分享一篇發(fā)表在Nature Chemistry上的文章，題目為“Engineered reactivity of a bacterial E1-like enzyme enables ATP-driven modification of protein and peptide C termini”，通訊作者是來自美國威斯康星大學(xué)麥迪遜分校的Amy M. Weeks教授，研究方向包括時空分辨的PTM研究、蛋白質(zhì)工程化改造以及化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)。在本文中，作者發(fā)展了一種基于蛋白酶促的C端標(biāo)記方式。
在生物體中，ATP 驅(qū)動的腺苷酸化（adenylation）可以為肽鍵形成提供熱力學(xué)動力（ΔG°′≈?46 kJ mol?1），然而目前科學(xué)家還缺乏利用這種策略的工具。目前主流的蛋白C端生物偶聯(lián)策略依賴于轉(zhuǎn)肽反應(yīng)，如sortase等。這些方法存在底物范圍窄、產(chǎn)率受限等缺陷。因此，本文作者希望開發(fā)了一個基于細(xì)菌樣泛素激活（E1）酶MccB的ATP驅(qū)動平臺，用于蛋白C端激活和肽連接。
大腸桿菌 MccB 是E1樣酶超家族的成員，可在消耗一分子ATP的條件下催化其七肽底物MccA（MRTGNAN）產(chǎn)生C端腺苷化（O-AMP）中間體，而后中間體與天冬酰胺側(cè)鏈酰胺反應(yīng)形成琥珀酰亞胺中間體，隨后被 N-AMP化并水解形成C端isoAsn-AMP產(chǎn)物。基于這一催化機(jī)制，作者提出可以將C端Asn突變?yōu)槠渌被崾沟玫孜锿Ａ粼贠-AMP這一步，在肽段本身在沒有親核性殘基的條件下可以通過外源引入親核試劑實(shí)際實(shí)現(xiàn)C端修飾。為實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，作者合成了一個將Asn突變?yōu)槠渌?9種氨基酸的MccA-N7X肽庫并檢測焦磷酸的生成，他們發(fā)現(xiàn)MccA-N7G突變催化效率最高，因此將其作為MccB底物，并命名為TeCH標(biāo)簽。
接下來，作者以C端修飾產(chǎn)物作為readout對親核試劑進(jìn)行了篩選。他們發(fā)現(xiàn)加入烷氧胺和肼能夠檢測到相應(yīng)質(zhì)量的C端修飾產(chǎn)物，但如果是基于苯肼的親核探針則無法修飾在MccA-N7G的C端，表明親核基團(tuán)的大小是影響修飾效率的重要因素。隨后他們發(fā)現(xiàn)硫醇親核試劑的反應(yīng)效率最高，均能以76-98 %的產(chǎn)量修飾MccA-N7G。
隨后，作者希望進(jìn)一步拓展C端修飾的酶和底物對，他們首先將MccA每個位置的氨基酸突變?yōu)槠渌?9種經(jīng)典氨基酸，但發(fā)現(xiàn)只有MccA-WT能夠完全轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物，表明 MccB對底物識別具有嚴(yán)格的特異性。作者又進(jìn)一步對其他細(xì)菌中MccB蛋白的非同源底物的催化活性，最終發(fā)現(xiàn)EcMccB/EcMccA、HpMccB/HpMccA 和 LjMccB/LjMccA可作為相互正交的酶-底物對。
最后，作者將此方法應(yīng)用在了表達(dá)蛋白連接（EPL）的體系中。Subtiligase在連接過程中存在水解副反應(yīng)，而在其基礎(chǔ)上加入MccB 進(jìn)行ATP依賴性硫酯的生成則可以使得水解產(chǎn)物再生，提高連接效率。作者實(shí)現(xiàn)了在1h內(nèi)將含疊氮/炔基的功能肽偶聯(lián)到5種不同蛋白，產(chǎn)率為70–99%。此外，作者還將此方法應(yīng)用在了細(xì)胞表面GFP特異染色等方面。
總的來說，本文中，作者基于E1樣蛋白MccB開發(fā)了一種用于C端修飾的ATP驅(qū)動平臺，實(shí)現(xiàn)了蛋白和多肽的C端修飾。
本文作者：WYQ
責(zé)任編輯：LYC
DOI：10.1038/s41557-025-01871-3
原文鏈接：https://doi.org/10.1038/s41557-025-01871-3
