分享一篇近期發(fā)表在J. Am. Chem. Soc.上的文章，題目是“Bioorthogonal Quinone Methide Decaging Enables Live-Cell Quantification of Tumor-Specific Immune Interactions”。文章的通訊作者為北京大學(xué)陳鵬和樊新元教授。
腫瘤的發(fā)生與復(fù)雜的細(xì)胞相互作用密切相關(guān)。有效的抗腫瘤細(xì)胞免疫取決于腫瘤與細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞，特別是細(xì)胞毒性T細(xì)胞(ctl)之間的特異性相互作用。這些相互作用直接影響腫瘤的消退和潛在的根除，強(qiáng)調(diào)了研究這些不同的CCIs對(duì)表征免疫反應(yīng)和指導(dǎo)免疫治療應(yīng)用的重要性。但這種相互作用仍然難以直接表征，這主要是由于它們的動(dòng)態(tài)性、細(xì)胞間通訊的復(fù)雜性和規(guī)避機(jī)制。近距離標(biāo)記方法已經(jīng)開(kāi)發(fā)出來(lái)，通過(guò)在接觸環(huán)境中原位細(xì)胞標(biāo)記來(lái)研究細(xì)胞相互作用，促進(jìn)檢測(cè)，分離和下游分析，但是這些方法的應(yīng)用受限于基因?qū)用娌僮鳌?fù)雜的偶聯(lián)物的合成、額外的細(xì)胞刺激損傷或是專職抗原提呈細(xì)胞相關(guān)的應(yīng)用范圍。考慮到腫瘤T細(xì)胞相互作用的特異性和復(fù)雜性，作者設(shè)想一個(gè)合適的接近標(biāo)記平臺(tái)將滿足以下屬性: (i)足夠的選擇性來(lái)檢測(cè)特定的細(xì)胞相互作用，(ii)中間體的廣泛反應(yīng)性，以確保標(biāo)記具有不同強(qiáng)度和界面間隙距離的CCIs的敏感性， (iii)對(duì)原代和/或難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類型或組織樣本進(jìn)行非遺傳操作，(iv)具有無(wú)創(chuàng)和可控的時(shí)空分辨率標(biāo)記能力，以避免破壞標(biāo)記的細(xì)胞，以及(v)化學(xué)可調(diào)性，以廣泛適用。本研究提出了一種基于醌類化合物的生物正交光催化細(xì)胞相互作用標(biāo)記策略，命名為CAT-Cell，用于檢測(cè)和量化腫瘤T細(xì)胞相互作用。誘餌細(xì)胞以非遺傳方式配備了銥光催化劑。這使得誘餌細(xì)胞在可見(jiàn)光照射下產(chǎn)生反應(yīng)性QM中間體，隨后標(biāo)記靠近的相互作用細(xì)胞。QM探針的化學(xué)適應(yīng)性確保了CAT-Cell檢測(cè)多種受體配體對(duì)誘導(dǎo)的CCIs的敏感性和效率，使該方法能夠量化不同強(qiáng)度的腫瘤T細(xì)胞相互作用，并研究腫瘤特異性T細(xì)胞在原代樣品中的腫瘤識(shí)別。此外，還通過(guò)將CAT-Cell與基于抗體的靶向系統(tǒng)相結(jié)合，證明了它的廣泛應(yīng)用，并證明了NK細(xì)胞的標(biāo)記能力。這些證明強(qiáng)調(diào)了CAT-Cell作為敏感和定量解剖腫瘤T細(xì)胞相互作用的一種有價(jià)值和通用的方法，它可以反映相互作用的強(qiáng)度以及免疫反應(yīng)的程度。首先，作者合理設(shè)計(jì)和優(yōu)化了亞甲基醌探針的結(jié)構(gòu)，通過(guò)調(diào)整探針中間體的活性和擴(kuò)散半徑，使其適配于細(xì)胞間標(biāo)記的環(huán)境與空間距離。之后，他們分別在小分子、蛋白質(zhì)層面對(duì)該標(biāo)記反應(yīng)進(jìn)行表征，并在CD40-CD40L介導(dǎo)的HEK293T細(xì)胞互作體系中進(jìn)行了細(xì)胞間標(biāo)記的驗(yàn)證。此外，作者們還將CAT-Cell策略與抗體靶向平臺(tái)相結(jié)合，通過(guò)制備納米抗體—光催化劑偶聯(lián)物成功實(shí)現(xiàn)了特定腫瘤細(xì)胞的互作細(xì)胞鑒定與分析，展示了該策略應(yīng)用于多種場(chǎng)景的潛力（圖1）。
圖1. 用于蛋白質(zhì)和細(xì)胞水平接近標(biāo)記的CAT-Cell的發(fā)展。
接下來(lái)，作者評(píng)估了其在原代組織樣本中識(shí)別腫瘤T細(xì)胞相互作用的可行性。CAT-Cell技術(shù)實(shí)現(xiàn)了模型抗原卵清蛋白(OVA)引發(fā)的MC38小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞與OT-I轉(zhuǎn)基因小鼠脾細(xì)胞CD8+ T細(xì)胞的相互作用的檢測(cè)（圖2a-d）。同時(shí)，CAT-Cell具備在低豐度腫瘤特異性T細(xì)胞混合系統(tǒng)中檢測(cè)腫瘤T細(xì)胞相互作用的能力（圖2 e, f）。
圖2. CAT-Cell能夠從小鼠模型中檢測(cè)腫瘤特異性T細(xì)胞。
在腫瘤微環(huán)境中存在多種腫瘤—免疫細(xì)胞相互作用，其中pMHC-TCR介導(dǎo)的細(xì)胞間相互作用對(duì)于研究殺傷性免疫細(xì)胞特別是抗原特異性T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別具有重要意義。然而，由于TCR具有高度多樣性和親和力低的特點(diǎn)，解析pMHC-TCR介導(dǎo)的互作細(xì)胞信息十分具有挑戰(zhàn)。接下來(lái)，作者利用CAT-Cell技術(shù)對(duì)腫瘤細(xì)胞和腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(til)之間的相互作用進(jìn)行考察。以MC38-OVA和MC38-B2M KO腫瘤為模型（β-2微球蛋白(B2M)是MHC-I復(fù)合物抗原呈遞功能的關(guān)鍵組成部分。B2M突變會(huì)導(dǎo)致MHC-I表達(dá)降低，進(jìn)一步導(dǎo)致抗原呈遞不足，從而影響T細(xì)胞識(shí)別，幫助腫瘤逃避免疫應(yīng)答。）。將這些實(shí)體瘤消化成單細(xì)胞懸液。[Ir]預(yù)處理的MC38細(xì)胞分別負(fù)載OVA257 264或GP33 41肽作為不同的誘餌細(xì)胞，然后與這些腫瘤單細(xì)胞懸液共培養(yǎng)，然后用CAT-Cell標(biāo)記相互作用的TILs(圖3a)。值得注意的是，只有當(dāng)OVA257 264引物的MC38細(xì)胞與MC38- ova腫瘤細(xì)胞懸液孵育時(shí)，才觀察到CD8+ T細(xì)胞的顯著生物素化，證實(shí)了腫瘤特異性CD8+ T細(xì)胞的成功檢測(cè)(圖3b,c)。同時(shí)，生物素化的增加與PD-1、TIM-3、CD39、CD137、CD25和CD44的表達(dá)上調(diào)呈正相關(guān)(圖5d、e)。這表明相互作用的CD8+ T細(xì)胞表現(xiàn)出激活和/或功能障礙表型，證實(shí)了它們的抗腫瘤潛力。
圖3. 腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞中腫瘤特異性T細(xì)胞的體外定量表征。
除了CD8+ T細(xì)胞外，作者還評(píng)估了CAT-Cell在研究腫瘤NK細(xì)胞相互作用中的標(biāo)記能力。在這里，我們分別使用MC38-B2M KO和MC38-WT細(xì)胞作為誘餌細(xì)胞，并使用CAT-Cell分析不同靶細(xì)胞NK相互作用的變化(圖4)。這些發(fā)現(xiàn)突出了我們方法的特異性和敏感性，展示了cat細(xì)胞引入的生物素信號(hào)如何作為相互作用狀態(tài)的敏感化學(xué)標(biāo)記物，潛在地克服了其他局限性。CAT-Cell所采用的多種衰變化學(xué)使其具有破譯多種腫瘤免疫細(xì)胞相互作用的顯著潛力。
圖4. 整合CAT-Cell與抗體為基礎(chǔ)的靶向系統(tǒng)和其他免疫細(xì)胞類型。
綜上所述，作者利用亞甲基醌類探針?lè)磻?yīng)底物的廣泛性、化學(xué)可控性和生物相容性，結(jié)合具有時(shí)空分辨率的光催化生物正交剪切反應(yīng)，發(fā)展了表征細(xì)胞間相互作用的CAT-Cell策略。該策略高效、靈敏、通用、溫和且無(wú)需基因操作，可以幫助研究者們?cè)跊](méi)有預(yù)先了解介導(dǎo)細(xì)胞互作的分子信息的情況下，對(duì)多種細(xì)胞—細(xì)胞相互作用進(jìn)行分析，為研究腫瘤細(xì)胞特異性識(shí)別進(jìn)而深入解析免疫應(yīng)答機(jī)制提供了有力工具。同時(shí)，該策略進(jìn)一步將生物正交光催化這類新型化學(xué)生物學(xué)技術(shù)從胞內(nèi)和胞膜拓展到細(xì)胞-細(xì)胞之間，充分體現(xiàn)了新型技術(shù)在生命科學(xué)研究中的巨大潛力和優(yōu)勢(shì)。
