分享一篇近期發(fā)表在Anal. Chem.上的文章，題目是“Novel Near-Infrared Fluorescent Probe for Hepatocyte Growth Factor in Vivo Imaging in Surgical Navigation of Colorectal Cancer”。文章的通訊作者是江西中醫(yī)藥大學(xué)的潘華萍教授。
本文報(bào)導(dǎo)了一種針對(duì)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)的新型近紅外熒光探針V-1-GGGK-MPA，該探針在結(jié)直腸癌(CRC)的手術(shù)導(dǎo)航中展現(xiàn)出活體成像的潛力。盡管近年來(lái)結(jié)直腸癌治療有所進(jìn)展，但復(fù)發(fā)率和肝臟轉(zhuǎn)移仍是導(dǎo)致預(yù)后不良的主要原因。研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)的V-1-GGGK-MPA探針，利用近紅外熒光染料標(biāo)記，能夠特異性結(jié)合CRC中過(guò)表達(dá)的HGF，為實(shí)時(shí)腫瘤切除手術(shù)提供熒光引導(dǎo)。實(shí)驗(yàn)顯示，V-1-GGGK肽段對(duì)HGF陽(yáng)性的體外腫瘤細(xì)胞和體內(nèi)腫瘤具有高特異性和選擇性。在多種皮下CRC模型中，注射后12小時(shí)，探針在腫瘤中的積累顯著，背景吸收低，腫瘤與結(jié)直腸的信噪比(SNR)值大于6。在SW480和HT29原位及肝臟轉(zhuǎn)移模型中，探針的攝取量經(jīng)量化分析確認(rèn)，腫瘤與結(jié)直腸和肝臟的SNR值分別為5.6±0.4、4.6±0.5和2.1±0.3、2.0±0.5，實(shí)現(xiàn)了腫瘤的精確成像，有助于手術(shù)導(dǎo)航。采用蛋白質(zhì)印跡法評(píng)估 CRC SW480、HT29 和 HCT116 腫瘤組織以及三陰性乳腺癌（TNBC） MDA-MB-231 腫瘤組織中的 HGF 和 c-Met 表達(dá)水平。結(jié)果表明，HGF和c-Met在SW480、HT29和HCT116腫瘤組織中的表達(dá)相當(dāng)，顯著高于MDA-MB-231腫瘤組織（圖1a），提示HGF和c-Met的表達(dá)呈正相關(guān)。此外，Western blot分析的結(jié)果表明，norleual及其類似肽V-1-GGGK通過(guò)抑制c-Met磷酸化有效地抑制了HGF誘導(dǎo)的c-Met激活（圖1b）。為了進(jìn)一步研究V-1-GGGK-MPA的結(jié)合特性對(duì)SW480、HT29、HCT116 CRC和MDA-MB-231細(xì)胞進(jìn)行了流式細(xì)胞術(shù)。在5μM濃度下，V-1-GGGK-MPA在SW480、HT29和HCT116細(xì)胞中表現(xiàn)出相當(dāng)?shù)慕Y(jié)合，這明顯強(qiáng)于在MDA-MB-231細(xì)胞中觀察到的結(jié)合（圖1c-e）。這表明與 MDA-MB-231 細(xì)胞相比，HGF 在 SW480、HT29 和 HCT116 細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，與蛋白質(zhì)印跡結(jié)果一致。在10μM濃度下，V-1-GGGK-MPA與SW480細(xì)胞的結(jié)合似乎比HT29和HCT116細(xì)胞強(qiáng)得多（圖1c-e），表明SW480細(xì)胞中V-1-GGGK-MPA相關(guān)蛋白的水平更高。飽和度分析進(jìn)一步提供了～3.6±0.28μM（SW480），～3.75±0.12μM（HT29）和～3.77±0.02μM（HCT116）的結(jié)合親和力值（圖1f）。
圖 1.HGF和c-Met表達(dá)，c-Met抑制和V-1-GGGK-MPA的結(jié)合特異性。（a） SW480、HT29、HCT116 和 MDA-MB-231 腫瘤組織中 HGF 和 c-Met 蛋白的表達(dá)水平 （n= 3）。（b） SW480 細(xì)胞 （n = 3） 中 HGF、V-1-GGGK 和 norleual 處理后的 c-Met 磷酸化水平。+ 表示管理，– 表示非管理。（c-e）SW480、HT29 和 HCT116 CRC 細(xì)胞中 V-1-GGGK-MPA 的結(jié)合分析 （n = 3）。在封閉實(shí)驗(yàn)中加入V-1-GGGK-MPA之前，將20倍未標(biāo)記的V-1-GGGK預(yù)孵育30分鐘（n = 3）。V-1-GGGK-NC-MPA作為具有擾亂序列的陰性對(duì)照 （NC） 組。（f） SW480、HT29 和 HCT116腫瘤細(xì)胞中 V-1-GGGK-MPA 的飽和度測(cè)定。
采用共聚焦激光顯微鏡監(jiān)測(cè)和可視化 HGF 陽(yáng)性 SW480、HT29 和 HCT116 細(xì)胞中 V-1-GGGK-FITC隨時(shí)間的分布。在與V-1-GGGK-FITC孵育10分鐘內(nèi)，HT29細(xì)胞的細(xì)胞膜中出現(xiàn)明顯的環(huán)狀熒光信號(hào)（圖2Ia），表明V-1-GGGK-FITC具有快速結(jié)合能力。30 和 60 分鐘后，觀察到增強(qiáng)的熒光信號(hào)和表現(xiàn)出局部或彌漫性細(xì)胞質(zhì)熒光的細(xì)胞的存在（圖 2Ib），表明 HT29 細(xì)胞內(nèi)化 V-1-GGGK-FITC，這是積累 V-1-GGGK-FITC 信號(hào)的關(guān)鍵方面。V-1-GGGK-FITC的綠色信號(hào)與質(zhì)膜染料DID的紅色信號(hào)共定位（圖2Ib-e），證實(shí)了V-1-GGGK-FITC的膜定位，共定位系數(shù)為0.92。在存在未標(biāo)記的 V-1-GGGK 作為特異性競(jìng)爭(zhēng)物的情況下，V-1-GGGK-FITC 的綠色熒光幾乎完全消失（圖 2Ig），證實(shí)了 V-1-GGGK-FITC 的特異性結(jié)合。同樣，在V-1-GGGK-NC-FITC（圖2Ih）處理后未觀察到綠色熒光，作為陰性對(duì)照。使用ImageJ軟件計(jì)算細(xì)胞核的平均熒光強(qiáng)度為校正后的總細(xì)胞熒光，揭示了SW480和HCT116細(xì)胞系中相似的分布模式，共定位系數(shù)分別為0.83和0.75（圖2IIa-h，IIIa-h）。正如預(yù)期的那樣，在MDA-MB-231腫瘤細(xì)胞中幾乎沒(méi)有檢測(cè)到V-1-GGGK-FITC和V-1-GGGK-NC-FITC的綠色熒光信號(hào)（圖2 IVa-h）。這些結(jié)果為進(jìn)一步探索肽V-1-GGGK在CRC腫瘤中的體內(nèi)靶向能力提供了依據(jù)。
