近日，南方科技大學王杰課題組在J. Am. Chem. Soc.雜志上發(fā)表了題為“Genetically Encoded Epoxide Warhead for Precise and Versatile Covalent Targeting of Proteins”的論文。
在這項工作中，作者開發(fā)了全新的帶有環(huán)氧乙烷結構的非天然氨基酸（EPOY），用于介導蛋白-蛋白互作界面間的化學交聯(lián)，實現(xiàn)了一個活性反應基團對多達10種天然氨基酸側鏈(H，M，C，K，D，E，Y，S，T，R)的廣譜鄰近交聯(lián)（圖1）。基于鄰近交聯(lián)的互作匹配（binding match）和化學匹配（reactivity match）的雙重選擇性，作者通過對KRAS蛋白的His-95殘基的共價靶向，在實現(xiàn)了對各種不同KRAS致癌突變體（G12-C/D/V/A/R/S, G13-C/D, Q61H）的廣譜性共價交聯(lián)的同時，實現(xiàn)了對KRAS、NRAS和HRAS的選擇性共價靶向，為新一代pan-KRAS共價抑制劑（共價靶向His-95）的開發(fā)提供有力的指引。圖1 EPOY非天然氨基酸及介導共價交聯(lián)反應示意圖近年來，共價藥物分子因其獨特的藥代動力學和藥效機制而被科學家們重視和關注。其中Bortezomib、ibrutinib、gefitinib等共價抑制劑相繼成功開發(fā)讓共價藥物站在了新藥開發(fā)的潮頭，KRAS-G12C的共價抑制劑Sotorasib的出現(xiàn)更是終結了KRAS這一重要靶點長達30年不可成藥的歷史。共價靶向的策略可以顯著延長藥物-靶標有效作用時間，使半衰期較短的分子也可以通過共價靶向的方式與靶標蛋白形成長效作用。并且共價靶向的策略可以實現(xiàn)藥物分子在靶標上的不可逆累積，實現(xiàn)較低親和力分子對高親和力分子的競爭逆轉。受啟發(fā)于共價小分子抑制劑，共價蛋白藥物是近年來新興的蛋白藥物概念。尤其是對于小蛋白藥物而言，例如納米抗體、細胞因子等，通過共價的策略可以顯著延長其與靶點蛋白的作用時長，改善其藥代和藥效動力學，提高成藥可能性。此外，由于共價蛋白藥物通過鄰近作用起效，所以必須同時進行正確的藥物--靶標“互作匹配”（binding match）以及“化學匹配”（reactivity match）才能與靶標形成共價鍵，這種雙重匹配的機制進一步提高了靶向藥物的特異性和目標選擇性，大大降低脫靶風險。在過去的研究中，已經(jīng)有非天然氨基酸被開發(fā)用于介導蛋白-蛋白互作界面的化學交聯(lián)。例如基于乙烯基磺酰胺基的VSF、pNCSF和基于丙烯酰胺官能團的AcrK、AcrF，基于鹵素的BrC6K、FPheK，以及基于磺酰氟官能團的非天然氨基酸FSY、FSK等。然而，大多數(shù)共價交聯(lián)基團面臨交聯(lián)效率低以及穩(wěn)定性不足等問題?；酋７Y構在一定程度上解決了交聯(lián)效率和穩(wěn)定性的問題，基于六價硫氟交換反應的FSY非天然氨基酸因具備較好的生物正交性、穩(wěn)定性和較高的交聯(lián)效率，使得共價蛋白藥物得到了快速的發(fā)展，并在后續(xù)的研究中被廣泛用來開發(fā)共價型的CAR-T，共價型的膜蛋白降解劑和共價型的細胞因子。但磺酰氟結構所能共價靶向的天然氨基酸殘基種類有限，僅能共價靶向少數(shù)幾種氨基酸側鏈（H, K, Y）?？紤]到蛋白質相互作用界面上的氨基酸種類繁多，其他具備親核性的氨基酸側鏈暫時未能實現(xiàn)共價靶向，這也在一定程度上限制了共價蛋白藥物的發(fā)展。因此，開發(fā)可遺傳編碼、生物相容性好、鄰近交聯(lián)反應范圍廣的共價反應基團，是發(fā)展共價蛋白藥物的關鍵。圖2 FDA批準的帶有環(huán)氧乙烷結構的藥物分子基于這一標準，作者把目光轉向了環(huán)氧乙烷結構。環(huán)氧乙烷是一種相對穩(wěn)定和安全的官能團，美國食品與藥物管理局（FDA）批準的幾種藥物的結構中都含有環(huán)氧乙烷結構，這證明了它在生理條件下的穩(wěn)定性和安全性（圖2）。此外，環(huán)氧乙烷還是一種高活性官能團，具備與各類氨基酸側鏈的親核基團發(fā)生反應的潛力；同時，環(huán)氧乙烷的化學反應活性可通過三元環(huán)上的取代基進行微調。因此，環(huán)氧乙烷結構具備了活體穩(wěn)定性、廣譜反應性和反應性可調的特點，有望成為共價蛋白交聯(lián)的理想官能團。
在此項研究工作中，作者設計并開發(fā)了攜帶有環(huán)氧乙烷共價反應基團的非天然氨基酸EPOY。根據(jù)交聯(lián)臂長以及環(huán)氧反應活性的可調性，作者設計合成了三種EPOY（圖3）并通過定向進化分別得到了可以識別三種EPOY氨基酸的氨酰tRNA合成酶（EPOY-RS），實現(xiàn)了對三種EPOY非天然氨基酸的遺傳編碼，可以將基于環(huán)氧乙烷的共價反應基團引入到目標蛋白的特定位點。圖4 環(huán)氧乙烷酪氨酸（EPOY3）的鄰近化學交聯(lián)反應性研究隨后，作者在免疫檢查點PD-L1和納米抗體KN035中測試驗證了EPOY介導蛋白-蛋白互作界面共價交聯(lián)的能力。作者將EPOY3定點插入納米抗體KN035的L108位，并將PD-L1的69位H突變?yōu)?種其它具有親核能力的氨基酸，同時構建H69A作為負對照，作者發(fā)現(xiàn)環(huán)氧乙烷可以與全部10種氨基酸殘基發(fā)生共價交聯(lián)且不與H69A突變體發(fā)生反應，這表明環(huán)氧乙烷可以精準介導納米抗體KN035與PD-L1蛋白發(fā)生位點特異性的共價交聯(lián)。作為對照，F(xiàn)SY在相同的相互作用界面和位點，僅能交聯(lián)3種氨基酸側鏈。在隨后的研究中，作者基于可遺傳編碼的環(huán)氧乙烷酪氨酸（EPOY）設計了可以廣譜性共價靶向KRAS致癌突變的泛KRAS共價結合蛋白，同時利用環(huán)氧乙烷對氨基酸側鏈的化學選擇性，實現(xiàn)了對KRAS、NRAS和HRAS選擇性共價靶向。KRAS蛋白的突變是許多癌癥中的關鍵驅動因素，針對KRAS的藥物開發(fā)長期以來一直面臨挑戰(zhàn)。KRAS-G12C突變體的共價抑制劑的成功，促進了其他KRAS突變抑制劑的快速發(fā)展。在最近的研究中，針對KRAS的G12D、G12R、G12S等突變也實現(xiàn)了共價靶向。然而，KRAS的其他多種致癌突變，如G12V、G12A和G13D，目前還缺乏有效的共價靶向方法，同時，共價靶向KRAS-SWITCH Ⅱ附近的致癌突變，其所開發(fā)的小分子抑制劑極易產(chǎn)生耐藥性，因此發(fā)展一種能同時抑制KRAS多種致癌突變的泛抑制策略顯得尤為重要（圖5）。作者認為要實現(xiàn)這樣的目標，需要靶向KRAS的特定表位。該表位的空間構象應當保持恒定，不受KRAS致癌突變的影響，也即不同的KRAS突變體之間蛋白構象重疊的較好的區(qū)域，這樣的表位才具備泛KRAS靶向的結構基礎。而這又帶來另一個問題，KRAS的同源蛋白HRAS/NRAS與KRAS在序列和結構上高度類似，KRAS的構象不受致癌突變影響區(qū)域，恰好也是K/N/H-RAS構象高度重疊的區(qū)域。如果靶向此區(qū)域（表位），在抑制KRAS的同時，也會抑制NRAS和HRAS的功能，這將帶來嚴重的副作用。因而，如何實現(xiàn)對不同KRAS突變體廣譜靶向的同時，實現(xiàn)對KRAS和HRAS/NRAS的精確區(qū)分是一個巨大的挑戰(zhàn)（圖5）。圖5 pan-KRAS共價靶向的機遇與挑戰(zhàn)作者對9種KRAS不同突變體的晶體結構進行對比，發(fā)現(xiàn)KRAS-H95所在的第三螺旋（86-110）結構的構象在不同的突變體結構相對保持恒定，是理想的pan-KRAS靶向的結構區(qū)域，為開發(fā)泛KRAS結合劑提供了可能。同時，通過對KRAS、HRAS、NRAS進行序列比對，作者發(fā)現(xiàn)在第三螺旋的95位和107位，KRAS擁有區(qū)別于HRAS、NRAS的氨基酸側鏈（圖5）。對于95位，KRAS上是組氨酸（H），NRAS上的是亮氨酸（L），HRAS上的是谷氨酰胺（Q），NRAS和HRAS上95號位的兩種殘基均不具備反應性，靶向H95殘基可以實現(xiàn)K/N/H-RAS之間的選擇性。類似地，對于107位，KRAS、NRAS和HRAS上的分別是谷氨酸（E）、天冬氨酸（D）和天冬氨酸（D）。盡管它們的側鏈都含有相同的反應基團（羧基），但天冬氨酸的側鏈比谷氨酸短一個碳原子，由于空間位阻和距離的原因，同樣有可能產(chǎn)生K/N/H-RAS之間的選擇性（圖5）。圖6 共價靶向H95實現(xiàn)對KRAS、HRAS/NRAS選擇性基于上述分析設計，作者選擇了可以靶向KRAS這一區(qū)域的結合蛋白DARPin-K13。DARPin是一類特殊的支架蛋白，通過改變結合界面的氨基酸和定向進化，DARPin可以與不同的目標蛋白結合，而DARPin-K13是通過噬菌體展示技術篩選到的KRAS結合蛋白。作者圍繞KRAS-H95和E107作為共價靶向目標，通過遺傳密碼子擴展技術將環(huán)氧乙烷結構引入DARPin-K13和KRAS蛋白的互作界面，并對EPOY3的插入位點進行了系統(tǒng)性的篩選。作者發(fā)現(xiàn)將環(huán)氧乙烷引入DARPin-K13的W35位可以共價交聯(lián)KRAS-H95，將環(huán)氧乙烷引入DARPin-K13的K133位可以共價交聯(lián)KRAS-E107。作者測試了在W35位點引入EPOY3后，DARPin-K13對于KRAS和HRAS與NRAS之間的選擇性。作者分別利用表達有KRAS、HRAS和NRAS的細胞裂解液與DARPin-K13進行孵育，結果顯示DARPin-K13僅交聯(lián)KRAS，而HRAS和NRAS不會與DARPin發(fā)生交聯(lián)，這表明共價靶向KRAS-H95和E107均可以實現(xiàn)對KRAS與HRAS/NRAS的選擇性（圖6）。隨后作者測試了腫瘤中突變頻率最高的KRAS前10種突變體，將過表達有不同突變體的細胞裂解液與DARPin-K13-W35-EPOY3孵育，結果表明DARPin-K13-W35-EPOY3可以與其中9種發(fā)生共價反應（圖7），突變率覆蓋度高達85%以上，證明了共價靶向H95可以實現(xiàn)對KRAS致癌突變體的廣譜靶向。總之，在本文中，作者通過開發(fā)一種全新的環(huán)氧乙烷結構的非天然氨基酸，在蛋白互作界面實現(xiàn)對多種天然氨基酸側鏈的廣譜鄰近交聯(lián)。通過共價靶向KRAS的H95位，作者成功發(fā)展了一種KRAS蛋白的選擇性泛抑制策略，不僅可以實現(xiàn)對各種不同KRAS致癌突變體的廣譜性共價靶向，還可以在K/N/H-RAS之間產(chǎn)生很好的選擇性，為新一代KRAS共價抑制劑的開發(fā)提供有力的參考。本文的通訊作者為南方科技大學化學系王杰副教授。南方科技大學化學系2023級博士張金鵬、2022級博士生王霞和研究助理黃清俊為本文的共同第一作者，2021級碩士生葉錦松亦為本研究做出了貢獻。該工作得到了國家自然科學基金委、科技部國家重點研發(fā)計劃、北京分子科學國家研究中心、深圳市科創(chuàng)委、深圳市醫(yī)學科院等項目的支持。原文鏈接：
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.4c03974
