推薦一篇發(fā)表在Nature Chemical Biology上的文章，文章的題目是: Imaging the dynamics of messenger RNA with a bright and stable green fluorescent RNA。通訊作者是華東理工大學(xué)的楊弋教授，朱麟勇教授和陳顯軍教授。楊弋教授課題組的研究對(duì)象為利用合成生物技術(shù)和光遺傳學(xué)技術(shù)控制和檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)分子過程的前沿技術(shù)，朱麟勇教授課題組的研究聚焦于光化學(xué)與生物醫(yī)用材料，陳顯軍教授的研究方向是針對(duì)DNA，RNA，蛋白質(zhì)等生物分子的光遺傳學(xué)檢測(cè)與控制技術(shù)。
綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein, GFP）是生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)中研究最廣泛、應(yīng)用最廣泛的熒光蛋白之一，GFP具有固定的熒光特性，成熟快速且安全，對(duì)融合蛋白具有良好的耐受性，并且在常規(guī)熒光儀器上使用標(biāo)準(zhǔn)濾光片可以方便地可視化。因此，GFP在研究蛋白動(dòng)力學(xué)和功能方面具有很大的用途，而且在活細(xì)胞和活體中檢測(cè)離子、代謝物信使和蛋白質(zhì)相互作用也有應(yīng)用。在熒光RNA方面，同樣綠色熒光蛋白與標(biāo)準(zhǔn)的綠色熒光蛋白濾光片的光譜擬合對(duì)細(xì)胞RNA的單色或多色成像特別有用。研究者于2019年在Nature Biotechnology上報(bào)道一種類似GFP的合成染料HBC，與熒光RNA適配體Pepper，Pepper可以特異性結(jié)合并激活HBC530發(fā)出強(qiáng)烈的綠色熒光，比之前存在的綠色熒光提高了一個(gè)數(shù)量級(jí)，但其光穩(wěn)定性有限。本研究的目的是開發(fā)出亮度更強(qiáng)，光穩(wěn)定性更好的綠色熒光RNA。
作者首先合成了一種非GFP樣熒光團(tuán)，稱為ACE (3-(2,3,6,7-tetrahydro-1H,5H-pyrido(3,2,1-ij)quinolin-9-yl)acrylamide-2-cyano-N-(2-(2-aminoethoxy) ethyl))，在溶液中具有低熒光，與HBC530相比，ACE的電子給體被兩個(gè)哌啶環(huán)鎖住以抵抗旋轉(zhuǎn)能量消耗，從而提高了熒光團(tuán)的熒光效率。此外，電子供體的剛性共面結(jié)構(gòu)使其更容易通過π -π相互作用被RNA結(jié)構(gòu)中的凸起基序牢牢鎖定。此外，含有聚乙二醇與氨基酸連接的電子受體可以為氫鍵提供給體和受體，這兩者都可以促進(jìn)熒光團(tuán)與RNA的相互作用。熒光團(tuán)-RNA親和力的提高可能有助于抑制熒光團(tuán)18的光異構(gòu)化。因此，我們認(rèn)為ACE將是開發(fā)具有高細(xì)胞亮度和光穩(wěn)定性的新型熒光RNA的絕佳候選者，并且RNA適配體結(jié)合的熒光團(tuán)的光漂白最小。為選擇與ACE結(jié)合的適配體，作者采用指數(shù)富集（SELEX）方法對(duì)配體進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化，經(jīng)過7輪SELEX后，洗脫的RNA文庫顯示，相對(duì)于原始RNA文庫，ACE的熒光激活顯著增強(qiáng)。對(duì)編碼RNA適體的互補(bǔ)DNA (cDNA)進(jìn)行測(cè)序，在這些適體中，其中一個(gè)適體A2表現(xiàn)出超過400倍的ACE熒光增強(qiáng)。接著作者對(duì)A2進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，對(duì)A2-T2截?cái)?，并?duì)A2-T2進(jìn)行單一和組合突變，最終篩選出C2A/C12U雙突變表達(dá)A2-T2的HEK293T細(xì)胞在ACE孵育下亮度最高，作者將其命名為“Okra”。
Okra-ACE的激發(fā)最大值在468 nm，發(fā)射最大值在505 nm，因此作者將這種RNA-熒光團(tuán)復(fù)合物命名為“Okra505”。作者比較了Okra-ACE與其它熒光RNA熒光強(qiáng)度和熒光穩(wěn)定性的差別，結(jié)果表明，Okra-ACE的整體背景熒光非常弱，熒光強(qiáng)度最佳，且具有很好的光穩(wěn)定性。mRNA的亞細(xì)胞定位可以為原核和真核細(xì)胞中基因表達(dá)的精確時(shí)空控制提供了一種機(jī)制，為了測(cè)試Okra是否可以檢測(cè)活細(xì)胞中的mRNA，作者在T7啟動(dòng)子控制的大腸桿菌中表達(dá)帶有F30-Okra標(biāo)記的3‘非編碼區(qū)mCherry mRNA，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，可觀察到綠色和紅色熒光，且綠色熒光強(qiáng)度高于mCherry-F30-Pepper和mCherry-F30-Broccoli的1.7倍和6.9倍，凸顯了Okra亮度的大幅增強(qiáng)。接著，作者使用Okra505檢測(cè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄的mRNA，實(shí)現(xiàn)了Okra505在活細(xì)胞水平的標(biāo)記。綜上，作者開發(fā)了綠色熒光RNA，具有熒光強(qiáng)度更好，穩(wěn)定性更佳的優(yōu)勢(shì)，可以實(shí)現(xiàn)在活菌和活細(xì)胞中的標(biāo)記，將為研究RNA動(dòng)力學(xué)和亞細(xì)胞定位提供幫助。原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41587-019-0249-1文章引用：DOI：10.1038/s41587-019-0249-1
