今天跟大家分享一篇發(fā)表在Analytical Chemistry上的文章，文章題目是“Electrochemical Immunosensor for Cardiac Troponin I Detection Based on Covalent Organic Framework and Enzyme-Catalyzed Signal Amplification”，本文的通訊作者是來自中國科學技術(shù)大學的楊秀榮院士，主要從事電分析化學、分子識別和生物分子相互作用及微流控分析化學的研究。本文提出了一種使用多功能共價有機骨架納米復合材料（HRP-Ab2-Au-COF）作為信號放大探針的高靈敏度電化學免疫傳感器，用于測定心肌肌鈣蛋白 I（cTnI）。提供了一種簡單的方法來定量測定實際樣品中的 cTnI，并拓寬了基于 COF 的納米復合材料在電化學免疫傳感器中的應用范圍。
急性心肌梗死（AMI）是冠心病中最嚴重的一種，對人類健康造成嚴重威脅。迄今為止，肌酸激酶-MB、肌紅蛋白、C反應蛋白和cTnI是診斷AMI的有價值的生物標志物。其中，cTnI是臨床應用中特異性最強、窗口期最長的生物標志物，被認為是AMI診斷的金標準。因此，開發(fā)一種快速靈敏的分析方法來檢測 cTnI 至關重要。基于抗原和抗體之間高特異性鑒定的免疫學檢測是生物標志物定性和定量檢測的重要分析方法。目前，許多基于酶聯(lián)免疫吸附測定的免疫測定方法，如化學發(fā)光免疫測定法、熒光法、表面增強拉曼散射法和比色法，已應用于cTnI檢測。與上述方法相比，電化學免疫傳感器以其響應速度快、選擇性強、靈敏度高、操作簡單等優(yōu)點引起了人們的廣泛關注。近年來，各種納米材料已被用于設計 cTnI 電化學免疫傳感器以提高檢測靈敏度。因此，設計新型功能納米材料并構(gòu)建電化學免疫傳感器以快速、選擇性和靈敏地測定 cTnI 具有重要意義和緊迫性。共價有機骨架（COF）是一種通過共價鍵將有機結(jié)構(gòu)單元連接在一起，形成具有周期性結(jié)構(gòu)的多孔結(jié)晶骨架的材料。它具有比表面積大、孔徑可調(diào)、孔隙率高、毒性低、生物相容性好等諸多獨特優(yōu)點。因此，COFs 已被用于許多研究領域，如藥物遞送、分離、催化、氣體吸附和儲存等。近年來，具有獨特多孔、電子和機械性能的 COFs 已與其他電活性材料一起功能化，以設計各種信號放大策略以提高電化學免疫傳感器的分析性能。然而，基于 COF 的 cTnI 電化學免疫傳感器的開發(fā)仍處于起步階段。基于上述背景，設計了一種基于COF的信號探針，首次用于cTnI的夾心式電化學免疫分析。構(gòu)建的電化學信號探針HRP-Ab2-Au-COF集靶點識別和信號放大功能于一體，COF表面負載的金納米粒子增強了電導率，促進了抗體(Ab2)的結(jié)合。當引入目標 cTnI 時，HRP-Ab2-Au-COF 通過抗體-抗原相互作用固定在電極表面，其中 H2O2-HRP 系統(tǒng)催化氧化氫醌 (HQ) 生成苯醌 (BQ)，然后進一步還原生成苯醌 (BQ)電化學信號。該生物傳感器對 cTnI 具有良好的分析性能，檢測限為 1.7 pg/mL，在實際樣品中的檢測結(jié)果令人滿意，表明其在臨床分析中目標蛋白的測定方面具有突出的應用前景。
方案1簡要說明了HRP-Ab2-Au-COF的制備過程和電化學免疫傳感器的組裝過程。首先，通過簡單的液相合成方法在室溫下由 TAPB 和 DMTP 制備球形 COF，在 NaBH4 通過 Au-NH2 結(jié)合還原的情況下，金納米粒子在 COF 表面原位生長。然后，Ab2 通過 Au-NH2 反應與金納米粒子結(jié)合。之后，HRP 通過主客體相互作用嵌入 COF 的孔中。值得注意的是，COF 在連接金納米粒子、Ab2 和 HRP 方面發(fā)揮了重要作用。此外，金納米粒子具有優(yōu)異的導電性，可以提高生物傳感器的靈敏度。由于COF的高孔隙率，大量的HRP分子被引入到納米復合材料中，實現(xiàn)了標簽從一對一到一對多的轉(zhuǎn)化模式。HRP與Ab2標記的COF結(jié)合，可同時實現(xiàn)目標識別和信號放大。為了檢測 cTnI，首先通過 Au-NH2 結(jié)合將捕獲抗體 Ab1 固定在裸 GE 的表面。用 BSA 封閉多余的活性位點后，修飾電極與不同濃度的 cTnI 孵育。最后，制備的 HRP-Ab2-Au-COF 生物偶聯(lián)物被 cTnI 捕獲。將修飾電極浸入電解液中后，H2O2 可以有效地將 HRP 氧化為 HRPOx，進而將 HQ 氧化為 BQ 并再生 HRPRed。接下來，BQ 在電極表面周圍被還原并產(chǎn)生明顯的電化學信號。通過這種 H2O2-HRP-HQ 催化循環(huán)，可以獲得放大的電流信號，并將設計的生物傳感器應用于 cTnI 的定量檢測。
SEM 和 TEM 用于表征 COF 材料的形態(tài)。COF 顯示出均勻的球形形態(tài)，表面粗糙（圖 A、B）。在 COF 上原位生長的金納米粒子大小約為 2.5 nm，分布均勻（圖 D、F）。值得注意的是，在金納米粒子生長和負載蛋白質(zhì)后，Au-COF 和 HRP-Ab2-Au-COF 的形態(tài)（圖 C-F）與 COF 相比保持不變。然而，與 COF (294.1 nm) 相比，Au-COF 和 HRP-Ab2-Au-COF 的流體動力學尺寸分別逐漸增加至 336.6 和 423.7 nm。COF 的 BET 表面積計算為 386.7 m2/g。此外，根據(jù) NLDFT 分析，COF 的孔體積和平均孔徑分別約為 0.56 cm3/g 和 2.88 nm。
HRP-Ab2-Au-COF 的元素映射顯示 Au 和 Fe 的均勻分散（圖 A），表明 Au 納米顆粒和 HRP 成功與 COF 結(jié)合。Au 4f 的 XPS 光譜如圖 B 所示。84.17 和 87.82 eV 的兩個峰分別歸因于 Au 4f7/2 和 4f5/2。根據(jù) ICP-OES 結(jié)果，Au 和 Fe 的含量分別約為 7.62% 和 0.063%。以上分析結(jié)果均證實了HRP-Ab2-Au-COF納米復合材料的成功合成。
為了確保傳感方法的可行性，進行了 CV 和 EIS 實驗來研究電極修改程序。如圖 A 所示，裸 GE 顯示出一個非常小的半圓，這證明了其出色的導電性。固定Ab1，用BSA封閉，捕獲cTnI后，電荷轉(zhuǎn)移電阻（Rct）依次增加，這是由于非電活性蛋白質(zhì)抑制了電子轉(zhuǎn)移。隨后，在與 HRP-Ab2-Au-COF 生物偶聯(lián)物結(jié)合后，Rct 進一步增加。此外，在沒有 cTnI 的情況下，與 HRP-Ab2-Au-COF 孵育的修飾電極顯示出與 BSA/Ab1/GE 相似的 Rct（曲線 d），表明可忽略不計的 HRP-Ab2-Au-COF 生物偶聯(lián)物非特異性吸附在電極表面。圖 B 中相應的 CV 曲線顯示，在逐步修改 Ab1、BSA、cTnI 和 HRP-Ab2-Au-COF 后，峰值電流降低，峰間分離度增加，這與 EIS 的結(jié)果一致。此外，圖 C 顯示了所提出的電化學生物傳感器在含有 HQ 和 H2O2 的 PBSI 溶液中有或沒有目標 cTnI 的 DPV 曲線。在沒有 cTnI 的情況下，生物傳感器在 -0.064 V 處顯示出很小的電流響應。然而，隨著 1 ng/mL 目標 cTnI 的加入，由于 H2O2-HRP-HQ 介導的信號放大，電流顯著增加了 4.6 倍.這些結(jié)果證明了所提出的生物傳感器的成功組裝和可行性。
在最佳實驗條件下，通過測量 DPV 響應電流來研究 cTnI 的濃度。從圖 6A、B 中可以看出，生物傳感器的 DPV 電流信號隨著 cTnI 濃度的增加而增強。響應電流在5 pg/mL～10 ng/mL范圍內(nèi)與cTnI濃度的對數(shù)呈線性關系，相關系數(shù)為0.9918。同時，計算出的檢測限為 1.7 pg/mL (S/N = 3)。在臨床研究中，cTnI 濃度在 0.5 至 2.0 ng/mL 之間被視為正常人和患者的分界線。因此，該方法可用于檢測實際樣品中的 cTnI。 總之，構(gòu)建了一個基于COF的電化學生物傳感平臺用于cTnI的定量測定。鑒于高孔隙率的優(yōu)勢，大量的HRP被封裝在COF中，可以在H2O2的幫助下有效地促進HQ氧化為BQ，進而顯著放大BQ的電化學還原信號。同時，COF良好的生物相容性可以保持酶的活性和穩(wěn)定性。此外，在 COF 表面原位生長的金納米粒子不僅有利于 Ab2 的固定，而且還提高了電導率。結(jié)合上述優(yōu)點，設計的電化學生物傳感器檢測 cTnI 的線性范圍為 5 pg/mL 至 10 ng/mL，檢測限為 1.7 pg/mL，并表現(xiàn)出優(yōu)異的選擇性和重現(xiàn)性。所提出的免疫傳感器成功地用于實際樣品測定，顯示出良好的回收率和重現(xiàn)性。總之，我們構(gòu)建的基于 COF 的電化學免疫傳感器可以成為檢測其他生物標志物的通用方法。
