引言
外泌體糖蛋白參與許多關(guān)鍵的生理和病理過程，如信號傳遞、免疫抑制以及腫瘤轉(zhuǎn)移等。外泌體蛋白的糖基化定義了相關(guān)蛋白的功能，進(jìn)而決定了外泌體在細(xì)胞交流中的信號傳導(dǎo)特性。因此外泌體蛋白糖基化的表征對于外泌體的進(jìn)一步生物應(yīng)用是十分必要的。此前研究外泌體蛋白糖基化的策略如凝集素法和質(zhì)譜法等，需要從外泌體釋放靶標(biāo)蛋白，不能保證外泌體的完整性，因此不適用于生理狀態(tài)下外泌體蛋白糖基化的研究。糖代謝標(biāo)記（MGL）法可通過細(xì)胞培養(yǎng)和隨后的化學(xué)偶聯(lián)將化學(xué)功能基團(tuán)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜多糖中，從而不顯著影響細(xì)胞的完整性和功能。但到目前為止，MGL還未在外泌體蛋白糖基化的研究上得到應(yīng)用。 成果簡介 近期，廈門大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院楊朝勇教授團(tuán)隊(duì)在《Angew. Chem. Int. Ed.》上發(fā)表了題為“Coupling Aptamer-based Protein Tagging with Metabolic Glycan Labeling for In Situ Visualization and Biological Function Study of Exosomal Protein-Specific Glycosylation”的研究論文。在該研究中他們開發(fā)了一種基于蛋白特異性適配體標(biāo)簽和糖代謝標(biāo)記（ExoAp-MGL）的雙標(biāo)記策略來實(shí)現(xiàn)外泌體蛋白糖基化的原位可視化。他們選擇外泌體程序性細(xì)胞死亡配體1（exoPD-L1）作為研究靶點(diǎn)，首先利用MGL對外泌體表面唾液酸進(jìn)行糖代謝標(biāo)記，接著利用點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)引入DBCO-Cy5，用Cy3標(biāo)記的PD-L1適配體對PD-L1進(jìn)行識(shí)別。然后通過Cy5與Cy3之間的FRET信號實(shí)現(xiàn)對同一外泌體上蛋白糖基化的原位表征。 圖文解讀 示意圖1. ExoAp-MGL 策略用于表征外泌體PD-L1（exoPD-L1）糖基化的示意圖。 A) 細(xì)胞用Ac4ManNAz培養(yǎng)后分泌含有疊氮化唾液酸的外泌體。B) 炔基熒光染料DBCO-Cy5通過點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)與疊氮唾液酸進(jìn)行生物正交反應(yīng)，對其進(jìn)行標(biāo)記。C) Cy3標(biāo)記的PD-L1適配體用于PD-L1蛋白的識(shí)別。D) 利用Cy3標(biāo)記的PD-L1適配體和DBCO-Cy5標(biāo)記的唾液酸之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移實(shí)現(xiàn)exoPD-L1的原位熒光成像。 圖1. 代謝標(biāo)記的A375人黑色素瘤細(xì)胞外泌體的鑒定以及PD-L1識(shí)別分子（適配體和和抗體）的結(jié)合特性表征。A) 糖代謝標(biāo)記外泌體的透射電鏡（TEM）表征。B) 代謝標(biāo)記的外泌體尺寸數(shù)據(jù)。C) 抗體染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明標(biāo)準(zhǔn)外泌體和代謝標(biāo)記的外泌體具有相近的外泌體標(biāo)志物CD63，以及免疫檢查點(diǎn)PD-L1表達(dá)量。D) 免疫印跡實(shí)驗(yàn)對代謝標(biāo)記的外泌體PD-L1表達(dá)量以及去糖基化的分析。以上結(jié)果說明糖代謝標(biāo)記不會(huì)對外泌體的性質(zhì)產(chǎn)生明顯影響。E) PD-L1抗體與PD-L1適配體結(jié)合性能的流式細(xì)胞分析，說明MGL不影響抗體或適配體對PD-L1的識(shí)別。F) PD-L1適配體對exoPD-L1與PD-1相互作用的影響。 圖2. exoPD-L1 糖基化的可視化。A) 疊氮化唾液酸外泌體與炔基熒光染料DBCO-Cy5的生物正交反應(yīng)示意圖。B) 用Ac4ManNaz處理/不處理的A375細(xì)胞與DBCO-Cy5孵育后外泌體的熒光強(qiáng)度，結(jié)果表明DBCO和疊氮化唾液酸外泌體的生物正交反應(yīng)的成功進(jìn)行。C) 共聚焦成像結(jié)果表明只有在DBCO-Cy5 和Cy3標(biāo)記的PD-L1 適配體共孵育后才會(huì)有FRET信號，進(jìn)一步驗(yàn)證了ExoAp-MGL策略的可行性。 圖3. exoPD-L1糖基化對其與PD-1相互作用的影響。A) 代謝標(biāo)記的糖基化和去糖基化外泌體先后用DBCO-Cy5和Cy3標(biāo)記的PD-L1適配體標(biāo)記，然后與PD-1受體共孵育后的原位共聚焦成像。B) 共聚焦成像中熒光強(qiáng)度的定量分析。C) PD-1染色的熒光信號與FRET信號的皮爾遜相關(guān)性分析。以上結(jié)果表明了糖基化是外泌體PD-L1與PD-1相互作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，在兩者相互作用中發(fā)揮著重要作用。 圖4. exoPD-L1糖基化對CD8+ T細(xì)胞識(shí)別和抑制的影響。A) 代謝標(biāo)記的外泌體用/不用PNG酶F處理，再用Cy3標(biāo)記的PD-L1 適配體和DBCO-Cy5標(biāo)記，并與CD8+T細(xì)胞共孵育后進(jìn)行共聚焦成像，用eFluor450標(biāo)記的CD8抗體鑒定CD8+T細(xì)胞。結(jié)果表明糖基化有利于PD-L1對PD-1表達(dá)的CD8+T細(xì)胞的識(shí)別。B) 代謝標(biāo)記的糖基化/去糖基化外泌體與CD8+T細(xì)胞共孵育后細(xì)胞數(shù)量變化分析，說明exoPD-L1糖基化可能有助于抑制CD8+T細(xì)胞的增殖。C) exoPD-L1糖基化影響對CD8+T細(xì)胞識(shí)別和抑制其增殖的可能機(jī)理。 總結(jié)與展望 作者簡介 楊朝勇，國家杰出青年科學(xué)基金獲得者、廈門大學(xué)特聘教授、上海交通大學(xué)分子醫(yī)學(xué)研究院副院長、譜學(xué)分析與儀器教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室副主任、中國化學(xué)會(huì)化學(xué)生物學(xué)專業(yè)委員會(huì)副主任、美國化學(xué)會(huì)ACS Applied Bio Materials 副主編。于2006年在美國佛羅里達(dá)大學(xué)獲得博士學(xué)位，2006年9月至2007年12月在美國加州大學(xué)伯克利分校從事博士后研究。 主要研究領(lǐng)域未生物分析化學(xué)，在分子探針、微流控芯片、信號放大、單細(xì)胞分析等方向取得了創(chuàng)新性的成果。 宋彥齡，廈門大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院教授。主要研究方向?yàn)榉肿佣ㄏ蜻M(jìn)化、微納界面組裝及識(shí)別機(jī)制、微流控分析、液體活檢、單細(xì)胞分析、生物傳感。 文獻(xiàn)鏈接 https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/anie.202103696 編輯：龔波 審核：田風(fēng)玉 推送：袁燕燕
