今天給大家分享一篇近期發(fā)表在Biomacromolecules上的文章，題為：Phase-Separated Multienzyme Biosynthesis。這篇工作中，作者在相分離形成的蛋白質(zhì)凝集體中通過自組裝作用引入催化酶，在體外構(gòu)建了多酶生物合成體系。并且，相分離帶來的濃縮效應(yīng)，促使級聯(lián)酶促反應(yīng)更高效的進行。文章的通訊作者是來自香港中文大學(xué)的夏江教授，他主要從事蛋白質(zhì)化學(xué)及酶工程方面的研究。液-液相分離（LLPS）是細胞中非常普遍的一個過程，生物大分子間通過多價相互作用，在高于臨界濃度時會自發(fā)形成凝集體。這些凝集體被稱為“無膜區(qū)室”，它們具有流動性與動態(tài)性，并且能夠選擇性地富集特定分子，從而提高級聯(lián)催化過程的效率。這是因為當(dāng)酶和底物聚集在凝集體中，可與其他代謝途徑隔離，并且底物通道效應(yīng)（級聯(lián)反應(yīng)過程中反應(yīng)中間物在兩個酶之間的直接傳遞）也使得酶促反應(yīng)的速率大大提高。先前已有將相分離過程應(yīng)用于多酶復(fù)合物的策略，例如通過將相形成過程中的骨架蛋白與被招募的蛋白直接融合表達，但這可能會影響正常的相分離過程。因此，作者在這里提出一種通過肽-肽相互作用將被招募者引入凝集體中的方法。作者選擇了一對高親和力相互作用的短肽，RIDD與RIAD。而用于與酶進行組裝的相分離體系由三種骨架蛋白組成，GKAP、Shank、Homer（它們是突觸后致密區(qū)PSD中的主要蛋白，混合后可以發(fā)生相分離并自發(fā)形成凝集體）。作者首先探究了引入多肽RIAD是否會對正常的相分離過程產(chǎn)生影響。通過融合表達構(gòu)建RIAD-Shank與RIAD-Homer，并與GKAP混合，獲得了渾濁溶液。顯微鏡下可以觀察到凝集體，超速離心分離沉淀相并進行SDS-PAGE也能夠觀察到大多數(shù)的骨架蛋白，如圖1所示。以上的結(jié)果說明成功發(fā)生相分離，RIAD的融合幾乎沒有影響。
圖1. RIAD融合后的相分離體系 (A)設(shè)計原理 (B)SDS-PAGE結(jié)果
隨后作者通過RIDD-RIAD相互作用將蛋白引入到凝集體中。首先以單個蛋白EGFP-RIDD作為模型進行嘗試。激光共聚焦顯微鏡的結(jié)果表明通過簡單的混合，即可有效的將EGFP-RIDD引入到凝集體中，凝集體中的熒光信號比溶液中高出50倍。對凝集體中原有骨架蛋白的分析等也表明凝集體的正常性質(zhì)沒有受到被引入蛋白的影響。
進一步地，作者測試了凝集體中同時引入兩種熒光蛋白，分別構(gòu)建了CFP-RIDD與YFP-RIDD。如圖2B，可以觀察到CFP與YFP熒光信號的共定位，這說明一個凝集體中能夠同時引入兩種蛋白。通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）的實驗，如圖2C，CFP的熒光壽命在加入YFP后降低，表明凝集體中CFP與YFP距離接近能夠發(fā)生FRET反應(yīng)。
圖2. 凝集體中肽-肽相互作用驅(qū)動兩種熒光蛋白的組裝 (A)設(shè)計原理 (B)激光共聚焦顯微鏡
(C)熒光共振能量轉(zhuǎn)移測定供體熒光壽命
接下來作者將一個級聯(lián)酶促反應(yīng)體系引入至凝集體中。Idi與IspA是萜類生物合成中關(guān)鍵的兩個酶。分別構(gòu)建Idi-RIDD與RIDD-IspA，并通過Cy5熒光標記。作者構(gòu)建了三個多酶催化系統(tǒng)，以比較有無肽-肽相互作用時的催化效率。結(jié)果如圖3所示，兩種酶在凝集體中得到顯著富集；表觀反應(yīng)速率反映RIDD-RIAD相互作用使催化活性提高了50%。
圖3. 凝集體中萜類合成酶的組裝促進催化 (A)三種酶體系示意圖(B)激光共聚焦顯微鏡 (C)三種酶體系中初始產(chǎn)物生成速率
綜上所述，在這項研究中，作者將能發(fā)生相分離的一些蛋白設(shè)計為支架，并通過設(shè)計的特異肽-肽相互作用驅(qū)動多種酶與凝集體的同時組裝。文中的例子表明，通過這種物理組裝將相分離體系與多酶催化結(jié)合，能夠帶來顯著的富集效果與提高的催化活性。
作者：ZRC 審校：SJL
DOI: 10.1021/acs.biomac.0c00321
Link: https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.biomac.0c00321
