自1871年首次合成熒光素以來，這種多功能分子一直是生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和化學(xué)生物學(xué)中應(yīng)用最廣泛的熒光團(tuán)之一。熒光素和相關(guān)的氧雜蒽染料的廣泛應(yīng)用，部分是由于它們的高亮度和廣泛的顏色范圍，只需對(duì)氧雜蒽熒光團(tuán)核心的末端和橋頭原子進(jìn)行簡單的修改即可。熒光素末端氧原子被氮取代產(chǎn)生另一類氧雜蒽熒光團(tuán)，即羅丹明。用碳、硅、磷、或硫取代熒光素10′氧原子可以紅移激發(fā)和發(fā)射波長，避免了光毒性和自發(fā)熒光的相關(guān)問題，并提高了體內(nèi)成像的組織穿透能力。相比之下，熒光素的3-羧酸鹽的取代仍然沒有得到充分的研究。3-取代基限制了內(nèi)消旋環(huán)的自由旋轉(zhuǎn)，提高了熒光量子產(chǎn)量。在熒光素3號(hào)位連上磺酸鹽，不會(huì)螺環(huán)化，并改善了其水溶性，這些特性在基于熒光素的電壓敏感型熒光團(tuán)(VF染料)的設(shè)計(jì)中起到了重要作用。雖然3位磺酸基熒光素在熒光素報(bào)道13年后就有報(bào)道。但涉及生物相關(guān)的磷酸基團(tuán)，3-磷酸基熒光素至今仍未有報(bào)道。作者探索這類未報(bào)道的3-膦熒光素所具有獨(dú)特的性質(zhì)。 加州大學(xué)伯克利分?；瘜W(xué)與分子細(xì)胞生物學(xué)助理教授Miller Evan在J. Am. Chem. Soc.上發(fā)表了題為“Phosphonofluoresceins: Synthesis, Spectroscopy, and Applications”的研究論文。在這篇論文中，作者首次開發(fā)了3-磷酸基熒光素的合成路線，表征了這類新的氧雜蒽染料的光譜性質(zhì)，并用3-磷酸基熒光素在細(xì)胞內(nèi)成像和膜電位傳感。3-磷酸基熒光素的雙乙酰氧基甲酯很容易進(jìn)入活細(xì)胞，表現(xiàn)出良好的積累和保留，與3-羧基熒光素相比，細(xì)胞亮度提高了近70倍。3-膦熒光素的游離酸形式不會(huì)穿過細(xì)胞膜，這使得它非常適合并入電壓敏感支架?；诖耍髡吆铣闪穗妷好舾袩傻臒晒鈭F(tuán)，即phosVF2.1.Cl和Phosphono-VF2.1.Cl，具有優(yōu)良的膜定位性、細(xì)胞亮度和電壓敏感性，可與磺酸基VF染料相媲美。 方案一，3-磷酸基熒光素的獨(dú)特性質(zhì)。3-磷酸基熒光素的吸收和發(fā)射相對(duì)母體3-羧基熒光素沒有太大的改變。與3-羧基熒光素相比，3-磷酸基熒光素的水溶性更強(qiáng)，即使在低pH值和低介電介質(zhì)中，3-羧基熒光素仍保持開環(huán)，可見光吸光狀態(tài)，而3-羧基熒光素傾向于內(nèi)酯化。3-磷酸基熒光素具有優(yōu)良的膜定位性、細(xì)胞亮度和電壓敏感性。 方案二，3-磷酸基熒光素的合成路線。在NiCl2催化下，2-溴苯甲醛1以65%的收率合成芳基磷酸酯2。濃鹽酸回流條件下水解為芳基磷酸3，使游離酸收率達(dá)到87%。3與間苯二酚在純甲烷磺酸中縮合得到二鹵代膦熒光素4和5。非鹵化熒光素膦(6)也可以通過這條路線制備，但轉(zhuǎn)化率較低，反應(yīng)時(shí)間較長。 表一，熒光素類化合物的理化性質(zhì)。pF.Cl(4)的溶解性幾乎是2,7 -二氯-3-羧基熒光素的兩倍，略低于sF.Cl。 圖一，二氯熒光素對(duì)pH依賴性的光譜表征。(a) 3-羧基熒光素歸一化吸光度譜圖。(b) 3-羧基熒光素的歸一化的吸光度隨pH變化的滴定曲線。(c) 3-羧基熒光素的pH平衡以及pKa。 (d) 3-磺酸基熒光素歸一化吸光度譜圖。(e) 3-磺酸基熒光素的歸一化的吸光度隨pH變化圖譜。(f) 3-磺酸基熒光素的pH平衡以及pKa。(g) 3-磷酸基熒光素歸一化吸光度譜圖。(h) 3-磷酸基熒光素的歸一化的吸光度隨pH變化圖譜。(i) 3--磷酸基熒光素的pH平衡以及pKa。通過pH滴定實(shí)驗(yàn)表明，3-磷酸基熒光素上有兩個(gè)酸性位點(diǎn)，第一個(gè)pKa高于3-磺酸熒光素，但低于3-羧酸熒光素，第二個(gè)pKa接近生理pH值，這為其功能化提供了機(jī)會(huì)。與3-羧基熒光素相比，3-磷酸基熒光素在生理pH值下的持續(xù)電離也可能增強(qiáng)水溶性。 方案三，乙酰甲基酯和醚代3-磷酸二氯熒光素的合成。溴甲基乙酸酯和氧化銀條件下，得到開環(huán)和閉環(huán)3-磷酸二氯熒光素兩種產(chǎn)物，以開環(huán)3-磷酸二氯熒光素為主產(chǎn)物。 圖二，3-磷酸二氯熒光素的細(xì)胞滲透性。(a, d) 500 nM 4孵育HEK293T細(xì)胞20 min后的細(xì)胞成像。(b, e) 500 nM 4-AM closed孵育HEK293T細(xì)胞20 min后的細(xì)胞成像。(c, f) 500 nM 4-AM open著染HEK293T細(xì)胞20 min后的細(xì)胞成像。4熒光分子不含AM酯，不能滲透細(xì)胞膜。4-AM closed的磷酸酯水解速度快由此產(chǎn)生的負(fù)電荷使其無法擴(kuò)散通過細(xì)胞膜。4-AM open處理的細(xì)胞具有強(qiáng)烈的細(xì)胞熒光，表明其細(xì)胞通透性高，且具有很高的熒光強(qiáng)度。 圖三，熒光素類熒光團(tuán)的細(xì)胞保留。(a) 熒光素AMs在HEK細(xì)胞中的相對(duì)亮度比較。(b) 500 nM 4-AM open和F-AM Closed孵育HEK293T細(xì)胞20 min后的細(xì)胞歸一化熒光強(qiáng)度。(c) 500 nM 4-AM open和F-AM Closed孵育HEK293T細(xì)胞20 min后的細(xì)胞成像。(d) 3-羧基羧熒光素AMs的化學(xué)結(jié)構(gòu) 方案三，基于3-磷酸熒光素的膜電位熒光團(tuán)的合成路線。 圖四，3-磷酸基熒光素膜電位染料在細(xì)胞和體外的表征。(a) para phosVF2.1Cl在0.1 M NaOH溶液中的歸一化吸收光譜(實(shí)線)和熒光發(fā)射光譜(虛線)。(a) 250 nM para phosVF2.1Cl 孵育HEK293T細(xì)胞20 min后的細(xì)胞成像。(c)在全細(xì)胞電壓鉗固定模式下，單個(gè)HEK293T細(xì)胞經(jīng)過100 ms超極化和去極化步驟(以20 mV為增量)后，para phosVF2.1Cl (17) 在HEK293T細(xì)胞的細(xì)胞膜上熒光隨時(shí)間的分?jǐn)?shù)變化曲線。(d) ΔF/F 隨最終膜電位變化圖，顯示電壓靈敏度約為26%/100 mV。 作者首次報(bào)道了3-磷酸基熒光素的合成，表征了這類新型熒光團(tuán)的光譜性質(zhì)，并在兩個(gè)正交活細(xì)胞成像應(yīng)用中使用了3-磷酸基熒光素。通過3-磷酸基熒光素的新合成路線，合成了非鹵化和2,7-二鹵化-3-磷酸基熒光素。其中，2,7-二氯-3-磷酸基熒光素比其他3-羧基類似物更容易溶于水。此外，合成了的5-或6-溴-3-磷酸基熒光素衍生物為電壓敏感的3-磷酸基熒光素。這些新的phosVF染料具有優(yōu)良的膜染色和電壓敏感性，可與性能最好的VF熒光素染料相媲美。3-磷酸基熒光素將在依賴于高度細(xì)胞保留的長期成像和電壓成像應(yīng)用中發(fā)揮作用。 https://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/jacs.1c01139 Miller Evan，加州大學(xué)伯克利分?；瘜W(xué)與分子細(xì)胞生物學(xué)助理教授 2004年，拿撒勒角大學(xué)，獲得生物/化學(xué)學(xué)士，哲學(xué)/神學(xué)學(xué)士。 2009年，加州大學(xué)伯克利分校，獲得化學(xué)博士(導(dǎo)師為Christopher J. Chang)。 2009-2013年，美國加州大學(xué)圣地亞哥分校從事博士后研究（導(dǎo)師為Roger Y. Tsien）。 2013年至今，美國加州大學(xué)伯克利分?；瘜W(xué)與分子與細(xì)胞生物學(xué)助理教授， 研究方向包括： 化學(xué)生物學(xué)，有機(jī)化學(xué)，熒光顯微鏡，神經(jīng)科學(xué)，成像。 編輯：韓嬌娜 審核：路栩 推送：胥奔鋒
J. Am. Chem. Soc.：3-磷酸基熒光素：合成、光譜和應(yīng)用
化學(xué)試劑
新材料產(chǎn)品
