引言
G4配體是能夠與G-四鏈體DNA(G4)緊密結合的小分子。在G4研究領域，大量的精力被用于篩選或合理的設計G4配體，故而，也發(fā)展了一系列被廣泛接受和常規(guī)實施的分析方法來評估它們在體外與G4的相互作用特性，并將它們作為創(chuàng)新的化學生物學工具來調控涉及G4S的細胞網絡。與之相反的是，迄今為止，只有相當少的破壞G4S穩(wěn)定的小分子被研究，盡管已經認識到，這種分子工具將在神經生物學中有巨大的應用，因為許多遺傳和年齡相關的疾病都是由G4S的過度代表引起的。造成這種情況的一個可能的因素是缺乏可靠的體外試驗來評估化學物質的G4展開特性。同時，由于尚未進行深入的細胞研究，關于使用這些化學物質作為解旋酶的替代品還沒有廣泛的共識。 成果簡介 近日，勃艮第大學ICMUB分子化學研究所高級研究員David Monchaud在《J. Am. Chem. Soc.》上發(fā)表了題為“Identifying G?Quadruplex-DNA-Disrupting Small Molecules”的研究論文。作者開發(fā)了一種體外檢測方法，以可靠地識別能夠破壞G4S穩(wěn)定的分子。這一工作流程包括新設計的G4-unfold分析，以及一系列經典的用于研究G4/配體相互作用的生物物理和生化技術(CD、UV?Vis、PAGE和FRET-熔化)，以及qPCR stop分析。 圖文解讀 圖1. 在G4-unfold實驗中評估的屬于一系列卟啉的分子(TMPyP4, TEGPy, TPPS, TArPS, and TEGP)，G4穩(wěn)定劑(PhenDC3, PDS, and BRACO19)，三芳基吡啶(Terpy)、氮雜環(huán)番(1，5-BisNPO、2，6-BisNPO和2，7-BisNPN)和G-鉗類似物(PhpC和GuaC)。 圖2. (A)Mendoza, Bourdoncle等開發(fā)的解旋酶分析示意圖。(B)適用于評估小分子的G4不穩(wěn)定性質的相關G4-展開試驗示意圖。 圖3. (A)通過增加TMPyP4(左)和PhpC(右)的量(1~20 mol當量)進行的G4-unfold分析獲得的實驗曲線。(插圖)對應的規(guī)格化曲線。小分子的存在既影響動力學(由圖3A中C-hTelo添加后的曲線斜率表示)，也影響雜交的熱力學(由最終熒光水平表示)。(B)用14種配體在4種不同濃度(1~20 mol當量，下進行G4-unfold分析時，用原始數(shù)據(jù)(左圖)或歸一化數(shù)據(jù)(右圖)獲得平均初始速度值(V0，in s?1)的熱圖；趨于暗紅色的值高于對照(V0=51.5 s?1)，趨于深青色的值低于對照值。從原始數(shù)據(jù)(左圖)和歸一化數(shù)據(jù)(右圖)清楚地區(qū)分了小分子對于G4不穩(wěn)定(紅色)和G4穩(wěn)定(青色)的作用。 圖4. 隨著6種化合物(TMPyP4，TPPS，PhenDC3，1,5-BisNPO，2,7-BisNPN和PhpC)量(0~10 mol當量)的增加，3 μM hTelo G4的CD(A)和UV?Vis滴定曲線以及CD和UV?Vis滴定中觀察到的變化隨著6種化合物含量的增加而變化的總結。 圖5. (A)hTelo和6種化合物(TMPyP4、TPPS、PhenDC3、1，5-BisNPO、2，7-BisNPN和PhpC)的不同的量(0~20 mol當量)進行PAGE實驗的結果定量。(B)F21T和增加6種化合物的加入量(0~10 mol當量)進行的FRET熔融實驗結果。隨著6種化合物含量的增加，PAGE和FRET熔融分析中觀察到的變化總結。總之，以上一系列的體外實驗結果表明，這些技術中的每一種都提供了被測試化合物與G4相互作用特性的不同數(shù)據(jù)，但不能單獨使用和信任。其中PhpC通過了所有測試，被證實具有G4展開作用。 圖6. (A)由Sabouri等人開發(fā)的qPCR停止試驗的示意圖。(B和C)在含有G4的鏈(B)或不含G4的對照鏈(C)的情況下，通過增加PhenDC3和PhpC的量(1~5 mol當量)進行qPCR停止分析研究的實驗曲線。實驗證明增加PhenDC3的量降低了G4鏈的擴增效率，而PhpC被發(fā)現(xiàn)可以促進擴增。(D和E)用1~5 mol當量的TMPyP4、TPPS、PhenDC3、PDS和PhpC在含有G4的鏈(D)和不含G4鏈但含有對照鏈(E)的實驗結果以及隨著5種化合物含量的增加，qPCR停止實驗中觀察到的變化總結，證明了PhpC展開G4的能力。 總結與展望 綜上所述，作者證明了卟啉作為DNA相互作用支架的多功能性，通過對它們的化學核心(電荷和側臂)的修飾，可以逆轉它們的結合特性。它在體外能夠有效地破壞G4結構，促進G4解旋酶的活性。除此之外，他們證明了一種結合不同技術(G4-unfold、CD、UV-Vis、PAGE、DLS、FRET-熔化、G4-解旋酶分析和qPCR停止分析)的多步驟方法的可靠性，以最可靠的方式評估可能的G4解離化合物的實際效率。這些技術是互補的，因為它們的固有優(yōu)點和缺點可以相互補充。 作者簡介 David Monchaud 勃艮第大學ICMUB分子化學研究所高級研究員。 研究方向：化學生物學，分子成像，光物理學，合成化學。 文獻鏈接 https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.1c04426 編輯：趙曉蕊 審核：楊思慧 推送：鐘彩君
