細胞轉(zhuǎn)錄組的復(fù)雜性給生物學(xué)家和化學(xué)家分析和理解許多單個RNA種類的動力學(xué)，折疊和功能帶來了挑戰(zhàn)。用于分析生物聚合物的最重要的化學(xué)策略之一是開發(fā)選擇性和有效的化學(xué)功能化方法。這樣的方法可以實現(xiàn)成像，定量，結(jié)構(gòu)分析和固定化，這是生物學(xué)和醫(yī)學(xué)中所有必不可少的工具。盡管蛋白質(zhì)的選擇性化學(xué)功能化反應(yīng)的開發(fā)在幾十年中取得了長足的進步，但與RNA形成化學(xué)鍵的方法的開發(fā)仍處于早期階段。特別是在轉(zhuǎn)錄的RNA的內(nèi)部位點形成鍵的方法仍然非常有限或非選擇性。以DNA為模板的1,N6-腺苷腺苷衍生物的產(chǎn)生提供了一種位點特異性RNA標記的方法，但需要密集的合成，延長的時間和較長的過程。重氮酮可用于與鏈中的無規(guī)磷酸鹽反應(yīng)；但是，在內(nèi)部位點會產(chǎn)生水解不穩(wěn)定的RNA磷酸三酯鍵。諸如補骨脂素之類的光交聯(lián)劑僅對折疊的RNA中的雙鏈區(qū)域具有選擇性，并且不用于特定功能化，而是用于結(jié)構(gòu)映射的產(chǎn)率較低。在胞嘧啶和腺嘌呤上發(fā)生反應(yīng)的堿基反應(yīng)劑（如二甲基硫酸鹽），在鳥嘌呤上發(fā)生反應(yīng)的茚三酮對未配對堿基的選擇性僅高于配對堿基，并阻止堿基配對。最后，許多在未配對核苷酸的2-OH基團上形成鍵的?；噭┮驯粡V泛用于痕量產(chǎn)率的結(jié)構(gòu)作圖。然而，由于它們的低溶解度和非常高的反應(yīng)性，它們通常不適合高產(chǎn)率官能化。重要的是，對于這些基本隨機反應(yīng)中的任何一種，都沒有報道用于序列選擇或位點選擇反應(yīng)的方法。 美國斯坦福大學(xué)的Eric T. Kool教授于本月在J.Am.Chem.Soc.上發(fā)表了一篇題為“Site-selective RNA Functionalization via DNA-induced Structure”的研究論文。文章通過開發(fā)一種用于RNA的定點酰化的通用策略來解決2-OH修飾選擇性的問題。 利用雙鏈結(jié)構(gòu)中RNA的低反應(yīng)性，利用互補的DNA寡核苷酸保護RNA中除所需反應(yīng)位點以外的所有反應(yīng)位，繼而誘導(dǎo)環(huán)上的RNA酰化（RAIL）的方法。文章顯示，可以通過適當(dāng)設(shè)計和廉價的輔助DNA誘導(dǎo)RNA中的反應(yīng)性缺口或環(huán)，從而在預(yù)定位點產(chǎn)生高產(chǎn)率的?；Ｔ摲椒ň哂行蛄羞x擇性，并且反應(yīng)以近核苷酸分辨率發(fā)生，并允許隨后的RNA標記和控制。 作者認為RAIL方法廣泛適用于許多RNA種類，并且可以為許多化學(xué)和生物學(xué)實驗室所用。 圖1 用于位點選擇性RNA酰化的RAIL方法的示意圖。 將目標RNA（R）與一個或多個互補輔助DNA（H）孵育以保護大部分RNA，但在環(huán)（a）或缺口（b）中留下單個未配對的核苷酸。 然后，暴露的2-OH基團可以與酰化試劑，例如NAI-N3，選擇性地反應(yīng)，在去除輔助DNA后產(chǎn)生位點定義的功能化RNA。 注意，大于單個核苷酸的環(huán)和缺口也是可能的。 圖2 優(yōu)化輔助DNA免受隨機RNA?；谋Ｗo。 （a）具有完整DNA補體的單鏈RNA（ssRNA）和RNA-DNA雙鏈的?；疽鈭D。 （b）?；?/span>ssRNA（R）的MALDI-TOF質(zhì)譜圖，完全互補DNA（R / H）保護的RNA，兩端均帶有三個脫氧腺苷（R / Ho）和2-deoxy- 3-磷酸修飾的RNA，具有3a突出端的完全互補DNA保護（Rp / Ho）； 在MOPS緩沖液中與50 mM NAI-N3在37℃反應(yīng)4h。 （c）逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）引物延伸的凝膠電泳分析顯示，由于受保護的RNA，除在中央C，U位點發(fā)生微量反應(yīng)外，一般都沒有終止位。 圖3 在DNA誘導(dǎo)的環(huán)上RNA?；谋碚?。 （a）示意圖顯示誘導(dǎo)的環(huán)RNA?；倪^程。 （b）DNA保護的RNA（Rp / Ho），DNA誘導(dǎo)的1nt凸起RNA（Rp / Ho-L1）和DNAPage誘導(dǎo)的3nt環(huán)RNA（Rp / Ho-L3）的MALDI-TOF質(zhì)譜與200 毫米NAIN3。 （c）與200 mM NAI-N3反應(yīng)的無環(huán)（R / Ho），1nt凸起（R / Ho-L1）和3nt環(huán)（R / Ho-L3）的RNA樣品的RT終止子的凝膠電泳分析。 凝膠中條帶的序列和位點如圖所示。 注意，RT終止（和相應(yīng)的條帶）出現(xiàn)在緊接?；瘹埢?/span>3的核苷酸處。 圖4 誘導(dǎo)缺口處RNA?；谋碚?。 （a）誘導(dǎo)間隙RNA?；襟E的示意圖。 （b）對無間隙（R / Ho），缺口（R / Ho-N），1nt間隙（R / Ho-G1）和3nt間隙（R / Ho-G3）的RNA樣品進行RT終止的凝膠電泳分析， 與200 mM NAI-N3反應(yīng)。 序列和位點如所示。 圖5 通過移動39 mer RNA靶中環(huán)或缺口的位置來編程局部酰化位點。 如圖所示，對于在不同位置具有1nt凸起或缺口的樣品，RT終止的PAGE分析。 凝膠中移位帶的比對序列如圖所示。 注意，RT終止（和相應(yīng)的條帶）出現(xiàn)在緊接反應(yīng)位置3的核苷酸處。 圖6 用于串聯(lián)核酶的現(xiàn)場選擇性可編程控制的RAIL方法。 （a）具有兩個催化核心（3TR，5TR）和兩個雙重標記的3S底物（3TR），5S（5TR）的串聯(lián)核酶的序列； 下面通過RAIL方法顯示TR的選擇性?；?，得到3TR?；暮嗣负?/span>5TR?；暮嗣?。 （b）RAIL方法的機制可實現(xiàn)對串聯(lián)核酶的位點選擇性控制。 （c）顯示相對于未反應(yīng)的TR（標準化為1.0）的每種底物（3S和5S）裂解的相對初始速率的圖。 圖7 連續(xù)RAIL方法對65nt小核仁RNA（SNORD78）進行雙重標記，并通過FRET觀察折疊。 （a）SNORD78 RNA序列，帶有藍色標記的標記位點（帶有Alex488的G14；帶有TAMRA的A49）。 通過兩個連續(xù)反應(yīng)進行RNA雙重標記的過程示意圖。 （b）雙標簽RNA凝膠分析的圖像； Alex488（綠色）和TAMRA（紅色）通道的疊加顯示兩種染料的重合。 （c）FRET信號響應(yīng)緩沖液相對于水的RNA結(jié)構(gòu)變化（供體在490 nm激發(fā)時發(fā)出熒光）。 在特定位點對RNA功能化的方法有很高的要求，但仍然是一個挑戰(zhàn)，特別是對于通過轉(zhuǎn)錄而不是通過全合成產(chǎn)生的RNA。最近的研究已經(jīng)描述了?；溥蛟噭撛噭┰诜菈A基配對的區(qū)域中以2-OH基團的高產(chǎn)率隨機反應(yīng)，覆蓋了分散的?；ブ械脑S多RNA。如果可能的話，局部反應(yīng)可能會在許多應(yīng)用中證明是有用的，可以在生物聚合物的特定位點和序列上提供功能性處理。在這篇文章里，作者描述了在定點的2-OH基團上進行RNA體外功能化的DNA定向策略。該方法稱為“誘導(dǎo)環(huán)RNA?；?/span>”（RAIL），它利用互補的輔助DNA寡核苷酸來暴露選定位置的缺口或環(huán)，同時保護DNA-RNA雙鏈體中的其余部分。然后進行與酰基咪唑試劑的反應(yīng)，從而在預(yù)定位點提供高產(chǎn)率的2-OH共軛。實驗揭示了最佳的輔助寡聚脫氧核苷酸設(shè)計和反應(yīng)條件，并對該方法進行了測試，以控制局部核酶活性并用雙色熒光染料標記RNA。 RAIL方法為可能進行任何長度和來源的RNA的位點選擇性標記和控制提供了一種簡單新穎的策略。 https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.0c06824 埃里克·庫爾（Eric T. Kool）生于伊利諾伊州的利伯蒂維爾（Libertyville），并在俄亥俄州牛津的邁阿密大學(xué)完成了本科學(xué)習(xí)。他以哥倫比亞大學(xué)NSF研究員的身份繼續(xù)從事有機化學(xué)研究生的研究，并獲得了博士學(xué)位。 1988年，以NIH博士后研究員的身份繼續(xù)在Caltech接受培訓(xùn)。 1990年，他加入了羅切斯特大學(xué)（University of Rochester）的教職，并于1997年晉升為教授。1999年，他將實驗室遷至斯坦福大學(xué)，在那里他是喬治·希爾達·道伯特（George and Hilda Daubert）化學(xué)教授。在斯坦福大學(xué)，他是Bio-X計劃（生物物理學(xué)計劃）的成員，并且是ChEM-H的會員。 Kool的研究興趣在于有機化學(xué)，化學(xué)生物學(xué)和生物物理學(xué)的跨學(xué)科領(lǐng)域。他的工作旨在設(shè)計新的功能上有用的分子工具，并將其應(yīng)用于對涉及核酸的生物相互作用和機理的基本了解。他最重要的貢獻之一是開發(fā)了稱為非極性核苷等位基因的DNA堿基模擬物，這使他的實驗室發(fā)現(xiàn)DNA復(fù)制可以在沒有Watson-Crick氫鍵的情況下發(fā)生。滾環(huán)擴增（RCA）和滾環(huán)轉(zhuǎn)錄（RCT）的發(fā)明，它們是等溫DNA / RNA擴增方法。設(shè)計的DNA堿基在活細胞中的首次成功應(yīng)用；從修飾的DNA開發(fā)許多熒光酶探針；以及用于成像和繪制細胞RNA結(jié)構(gòu)的分子探針的開發(fā)。迄今為止，已有超過275種出版物描述了Kool的工作，他在美國和國外舉辦了250多次受邀的演講。他的實驗室分子工具已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多有用的應(yīng)用，并且他是30項已授予或正在申請的專利的發(fā)明者。他的發(fā)明被用作三個不同生物技術(shù)公司的創(chuàng)始技術(shù)。庫爾因其研究而獲得了許多國家獎項，包括德雷福斯基金會教師-學(xué)者獎學(xué)金，阿爾弗雷德·P·斯隆基金會獎學(xué)金，美國化學(xué)學(xué)會的亞瑟·C·科普學(xué)者獎，ACS輝瑞獎和ACS Breslow獎。他還被任命為美國科學(xué)促進協(xié)會會員。 Kool在其實驗室中培訓(xùn)了120多名研究生和博士后研究人員；其中有三十多個已在全球擔(dān)任學(xué)術(shù)職務(wù)。他是斯坦福大學(xué)二年級有機化學(xué)的熱門老師，曾兩次獲得人文與科學(xué)學(xué)院院長杰出教學(xué)獎。 作者主頁：https://web.stanford.edu/group/kool/cgi-bin/wordpress/eric-t-kool/ 編輯：瓜西的向逆 審核：飛天貓的神經(jīng)刀
J.Am.Chem.Soc.: 通過dna誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)的位點選擇性RNA功能化
化學(xué)試劑
新材料產(chǎn)品
