酶活性的檢測對于臨床診斷、功能蛋白質(zhì)組學和藥物發(fā)現(xiàn)等許多應用都具有重要意義。迄今為止，科研工作者們已經(jīng)開發(fā)了用于檢測酶活性及篩選抑制劑的不同方法，包括質(zhì)譜、電化學、毛細管電泳、放射性標記、比色分析和熒光方法。但當前用于酶活性測量的方法通常具有較低的分析靈敏度。近年來，高效的小分子抑制劑已成為治療許多疾?。ɡ绨┌Y）的有效藥物，而精確分析具有亞納摩爾或皮摩爾范圍內(nèi)抑制常數(shù)（Ki）的緊密結合抑制劑需要接近或低于Ki值的低濃度酶。但較低濃度的酶產(chǎn)生的信號極弱，因此迫切需要一種可以進行超靈酶分析的檢測技術。 近日，來自哈佛大學醫(yī)學院的病理學教授David R. Walt在國際著名期刊《J. Am. Chem. Soc.》上發(fā)表了題為“Ultrasensitive Detection of Enzymatic Activity Using Single Molecule Arrays”的研究論文。本文中，作者開發(fā)了一種使用單分子陣列（eSimoa）檢測酶活性的超靈敏方法。利用生物功能化的磁珠捕獲目標分析物并保證每個磁珠結合的目標分析物為0或1。通過生物素化的檢測探針與磁珠上捕獲的目標分析物結合，并進一步用報告酶-鏈霉親和素-β-半乳糖苷酶（SβG）進行標記和分析，從而實現(xiàn)蛋白酶的超靈敏檢測。作者證明了eSimoa分析方法具有前所未有的靈敏度，可用于檢測蛋白激酶、端粒酶和多肽N-乙酰半乳糖胺基轉(zhuǎn)移酶的活性。 圖1 基于eSimoa分析方法使用多肽修飾的磁珠（MBs）作為基底檢測蛋白激酶活性的示意圖。在eSimoa分析中，將結合有底物多肽的MBs與目標酶和輔因子共同孵育，隨后反應得到的產(chǎn)物被生物素化的檢測探針所識別，并進一步被SβG標記用于Simoa分析。 圖2 檢測（A）原癌基因酪氨酸蛋白激酶（Src）和（B）Abelson小鼠白血病病毒致癌基因同源物1（Ab1）活性的響應曲線。采用eSimoa分析方法對Src和Ab1的檢測限分別為4.9 fM和4.2 fM，相比傳統(tǒng)的方法具有較高的靈敏度。 圖3 eSimoa用于端粒酶活性檢測的示意圖。將底物寡核苷酸預綴合至MB的表面，在存在dNTP混合物的情況下，以端粒酶的固有RNA作為模板，結合的端粒酶催化端粒重復序列(TTAGGG)n加到底物的3'端。溫育和磁分離后，將結合的端粒酶洗掉，并加入由互補序列組成的生物素標記的檢測探針。最后，添加SβG標記MB用于Simoa分析。 圖4 使用Simoa分析方法檢測端粒酶活性的響應曲線。 圖5 使用抑制劑bosutinib抑制Src（A）及Ab1（B）和使用抑制劑dasatinib抑制Src（C）及Ab1（D）的不同預孵育時間下的劑量反應曲線。這些結果表明，eSimoa分析方法可用于評估抑制劑的效力，尤其是用于篩選緊密結合的抑制劑。 圖6 （A）K562和（B）HEK293細胞裂解液中Ab1活性檢測的條形圖。結果表明，信號隨著細胞數(shù)量的增加而增加，檢測到的最低激酶濃度對應于從1個細胞中提取的K562濃度和從30個細胞中提取的HEK293濃度。 圖7 檢測單個細胞中Bcr-Ab1的活性（A）和平均信號變化（B）。當僅將緩沖液添加到單細胞裂解液中時，信號具有相對較寬的分布，證明了細胞之間的異質(zhì)Ab1活性。在存在抑制劑dasatinib和bosutinib的情況下，信號分布移至較低的AEB信號，并且平均信號由于抑制而降低。這些結果表明，eSimoa分析方法可用于測量單細胞中的激酶活性。 總而言之，本文作者通過將底物綴合到順磁性磁珠上并使用底物到產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化實現(xiàn)了eSimoa分析，同時采用eSimoa檢測方法成功檢測了Src，Ab1，端粒酶，SET7 / 9和GalNAcT的活性。盡管這些酶通過完全不同的機制和在不同類型的底物上起作用，但是eSimoa分析都可以實現(xiàn)酶的超靈敏檢測，這表明eSimoa方法是一種既靈敏又靈活的通用方法。并且eSimoa分析方法已成功用于確定抑制劑bosutinib和dasatinib的抑制常數(shù)。由于這種方法的超靈敏性，作者在單細胞水平上實現(xiàn)了激酶活性的檢測并為酶相關的基礎研究和抑制劑篩選提供了有希望的平臺。 David R.Walt是哈佛醫(yī)學院病理學系的教授，同時也是霍華德·休斯醫(yī)學院的教授，擁有密歇根大學的化學學士學位和博士學位，SUNY的化學生物學博士學位，并在MIT進行了博士后研究。他率先將微孔陣列用于單分子檢測和分析，徹底改變了基因和蛋白質(zhì)組測序的流程，使DNA測序和基因分型的成本在過去十年中下降了近百萬倍，并且這項技術現(xiàn)在已成為在各種應用中進行測序的金標準。他是Illumina公司和Quanterix Corp的科學創(chuàng)始人，并與其他幾家生命科學初創(chuàng)公司共同創(chuàng)立了公司。此前，他是塔夫茨大學的神經(jīng)科學與口腔醫(yī)學教授。目前他是美國國家工程研究院，美國國家醫(yī)學研究院的成員，美國藝術與科學研究院的院士，美國醫(yī)學與生物工程學院的院士以及美國發(fā)明家研究院的院士。他獲得了許多獎項和榮譽，包括2017年美國化學學會的凱瑟琳·C·哈赫（Kathryn C. Hach）企業(yè)家成功獎，2016年的拉爾夫·亞當斯生物分析化學獎，2014年美國化學學會古斯塔夫斯·約翰·埃瑟倫獎，2013年分析化學光譜化學分析獎，2013年匹茲堡分析化學獎和2010 ACS國家發(fā)明創(chuàng)造獎。 https://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/jacs.0c06599 編輯：迷信 審核：CK
J. Am. Chem. Soc.: 使用單分子陣列實現(xiàn)酶活性的超靈敏檢測
化學試劑
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