目前的研究發(fā)現(xiàn)在癌細(xì)胞內(nèi)大量檢測(cè)到G-四聯(lián)體（G4s），這可能與癌癥相關(guān)基因關(guān)系密切，并且推測(cè)G4s或許可以用作早期癌癥診斷和治療中新的分子靶標(biāo)。之前有關(guān)G4s的研究報(bào)道中所使用的觀察技術(shù)往往需要?dú)⑺兰?xì)胞或使用高濃度的化學(xué)探針，從而觀察G4s的形成。但由于細(xì)胞中G4s的穩(wěn)態(tài)性可能受到蛋白質(zhì)（例如解旋酶的調(diào)節(jié)），無(wú)法通過(guò)快速離體技術(shù)來(lái)追蹤G4s。此外，一些常用于檢測(cè)活細(xì)胞中DNA和RNA的探針濃度相對(duì)較高，這可能會(huì)干擾G4s的動(dòng)態(tài)折疊過(guò)程以及引起細(xì)胞應(yīng)激/毒性。
近日，英國(guó)劍橋大學(xué)化學(xué)與癌癥研究系的Shankar Balasubramanian教授課題組在Nature Chemistry上發(fā)表了一篇題為《Single-molecule visualization of DNA G-quadruplex formation in live cells》的研究論文。該研究報(bào)道了一種G4特異性熒光探針（SiR-PyPDS）能在低濃度的條件下，結(jié)合少量G4s就可以實(shí)時(shí)追蹤到活細(xì)胞核中的G4s的單個(gè)結(jié)構(gòu)分子，實(shí)現(xiàn)了在不干擾G4s動(dòng)態(tài)折疊的情況下，在活細(xì)胞中對(duì)其動(dòng)態(tài)過(guò)程進(jìn)行檢測(cè)。此外，還證明了活細(xì)胞中G4s的形成是細(xì)胞周期依賴(lài)性的，并受到化學(xué)抑制轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的破壞。
圖1 G4s的體外單分子熒光成像。（a）G4結(jié)構(gòu)（左）和G4二級(jí)結(jié)構(gòu)（右）的示意圖。（b）(1) G4特異性熒光探針（SiR-PyPDS）的化學(xué)結(jié)構(gòu)以及它的非活性異構(gòu)體SiR-iPyPDS(2)。SiR-PyPDS(1)是通過(guò)使用不同長(zhǎng)度的連接體將遠(yuǎn)紅色熒光團(tuán)硅羅丹明（SiR）與G4配體吡啶酮（PyPDS）的類(lèi)似物結(jié)合制備得到的。熒光滴定證實(shí)SiR-iPyPDS(2)的G4結(jié)合親和力比SiR-PyPDS(1)低10倍以上。（c）用于可視化單個(gè)G4的方法的示意圖。預(yù)折疊的G4-MYC通過(guò)生物素-中性親和素鏈接體連接到蓋玻片上。G4熒光探針SiR-PyPDS(1)與G4-MYC結(jié)合，可通過(guò)單分子熒光成像進(jìn)行觀察。（d）SiR-PyPDS不結(jié)合G4形成單鏈突變體MYC。（e）非活性異構(gòu)體SiR-iPyPDS(2)結(jié)合親和力較弱，與G4 MYC結(jié)合的可能性較小。（f）定量檢測(cè)SiR-PyPDS (1)與G4 MYC的結(jié)合，SiR-PyPDS (1)與突變體MYC (Mut)的結(jié)合，SiR-iPyPDS (2)與G4 MYC的結(jié)合，以及在10μM未標(biāo)記的PhenDC3存在的條件下，SiR-PyPDS (1)與G4 MYC的結(jié)合。（g）單個(gè)SiR-PyPDS(1)分子(250 pM)結(jié)合表面的預(yù)折疊MYC G4寡核苷酸的成像，單個(gè)熒光點(diǎn)狀物表明有單一的SiR-PyPDS(1)分子結(jié)合。（h）SiR-PyPDS(1) (250 pM)與突變體MYC結(jié)合的成像。（i）SiR-iPyPDS (2) (250 pM)與預(yù)折疊MYC結(jié)合的成像。（j）G4配體與G4s的相互作用可以改變G4s展開(kāi)和折疊之間的平衡。
圖2用熒光探針SiR-PyPDS(1)對(duì)活細(xì)胞G4s進(jìn)行單分子熒光成像。（a）細(xì)胞核內(nèi)G4s的示意圖，放大后顯示經(jīng)SiR-PyPDS染色的G4s(1)。（b）在成像前30分鐘，使用20 nM的SiR-PyPDS(1)處理的活U2OS細(xì)胞，熒光斑點(diǎn)表明單鏈與SiR-PyPDS(1)分子結(jié)合。藍(lán)色對(duì)應(yīng)于Hoechst 33342核染色。（c）使用20 nM的SiR-PyPDS(1)對(duì)U2OS活細(xì)胞處理30分鐘后，進(jìn)行SiR-iPyPDS(2)染色的代表性圖像。（d）對(duì)于SiR-PyPDS(1)和SiR-iPyPDS(2)，對(duì)每個(gè)細(xì)胞持續(xù)超過(guò)兩幀（每幀100 ms）的細(xì)胞核內(nèi)結(jié)合現(xiàn)象的定量分析。
圖3 活細(xì)胞中的G4s的動(dòng)態(tài)折疊和展開(kāi)過(guò)程（a）SiR-PyPDS(1)在體外(上)和細(xì)胞內(nèi)(下)的單分子延時(shí)成像。左邊顯示的是時(shí)間推移疊加的單個(gè)圖像，右邊則顯示了SiR-PyPDS(1)與G4s的動(dòng)態(tài)結(jié)合動(dòng)力學(xué)。（b）每個(gè)實(shí)驗(yàn)的駐留時(shí)間直方圖，用單指數(shù)擬合以確定每種條件下的結(jié)合壽命。（c）DMS對(duì)未折疊的G4s的化學(xué)捕獲的示意圖。（d）定量檢測(cè)未經(jīng)處理和經(jīng)600 μM MDMS處理的G4 NYC 20 min的G4結(jié)合事件。（e）DMS (20 mM)增加后，活細(xì)胞中檢測(cè)到G4結(jié)合事件的定量檢測(cè)，顯示出G4s明顯的時(shí)間依賴(lài)性消耗。以上結(jié)果證明，SiR-PyPDS結(jié)合G4s觀察到的時(shí)間相當(dāng)，說(shuō)明SiR-PyPDS可以用于檢測(cè)內(nèi)源性的G4s。
圖4 G4s在活細(xì)胞中的觀察受到細(xì)胞周期和轉(zhuǎn)錄的影響。（a）-（d），顯示了S期(a)、G1/S期(b)和G0/G1期(c)同步的U2OS細(xì)胞和同時(shí)使用轉(zhuǎn)錄抑制劑DRB和復(fù)制抑制劑阿非迪霉素(d)處理的未同步的細(xì)胞中G4結(jié)合事件的代表性單分子圖像。（e）在活的U2OS細(xì)胞中，在不同的細(xì)胞周期階段和轉(zhuǎn)錄/復(fù)制停止后，對(duì)每個(gè)細(xì)胞持續(xù)超過(guò)2幀（每幀100毫秒）的結(jié)合事件的定量。通過(guò)對(duì)活細(xì)胞中G4s的單分子可視化技術(shù),可以追蹤G4s在特定基因中的作用以及它們?cè)诎┌Y中的表達(dá)方式。
該研究發(fā)明了一種熒光標(biāo)記，它可以附著在人類(lèi)活細(xì)胞的DNA G-四聯(lián)體(G4s)上，首次可以觀察到這種特殊的DNA結(jié)構(gòu)的形成過(guò)程，以及它在細(xì)胞中行使的功能。這一成像平臺(tái)的進(jìn)一步應(yīng)用將有助于實(shí)時(shí)揭示人類(lèi)基因組中由個(gè)體G4調(diào)控的特定生物學(xué)功能。
https://www.nature.com/articles/s41557-020-0506-4
Shankar Balasubramanian，印度出生的英國(guó)化學(xué)家，劍橋大學(xué)化學(xué)系藥物化學(xué)教授，英國(guó)劍橋癌癥研究所高級(jí)組長(zhǎng)，劍橋三一學(xué)院研究員，Solexa和Cambridge Epigenetix的科學(xué)創(chuàng)始人。
編輯：今晚月色真美
審核：123
