英文原題：Concerted Chemoenzymatic Synthesis of α-Keto Acid through Compartmentalizing and Channeling of Metal-Organic Frameworks
通訊作者：Jiafu Shi (石家福)，Zhongyi Jiang (姜忠義)，天津大學(xué)
第一作者：Yizhou Wu (伍一洲)
生物制造是以生物技術(shù)為核心，利用酶或微生物細(xì)胞，結(jié)合化學(xué)工程技術(shù)進(jìn)行目標(biāo)產(chǎn)品的加工過(guò)程(綠色生物制造. 北京化工大學(xué)學(xué)報(bào), 2018, 45, 107)。酶催化因反應(yīng)條件溫和、活性高、目標(biāo)產(chǎn)物選擇性高等特點(diǎn)，在綠色生物制造領(lǐng)域表現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。定向進(jìn)化、合成生物學(xué)等新興技術(shù)的出現(xiàn)進(jìn)一步拓寬了酶催化的反應(yīng)條件和反應(yīng)類(lèi)型。然而，酶的一些固有特性，如氧化還原酶依賴(lài)輔酶，氧化酶易產(chǎn)生有毒副產(chǎn)物等，限制了酶催化的應(yīng)用范圍?；瘜W(xué)催化劑，例如貴金屬、金屬氧化物和有機(jī)金屬配合物等，已廣泛應(yīng)用于多種化學(xué)反應(yīng)。因此，研究者將酶催化與化學(xué)催化偶聯(lián)，結(jié)合酶催化劑高活性、高特異性與化學(xué)催化劑易獲取和多樣性等優(yōu)勢(shì)，開(kāi)發(fā)了酶-化學(xué)偶聯(lián)催化系統(tǒng)，拓寬了反應(yīng)路徑、促進(jìn)了副產(chǎn)物消除，提升了反應(yīng)效率，實(shí)現(xiàn)了燃料、精細(xì)化學(xué)品和藥物中間體的高效合成。
酶-化學(xué)偶聯(lián)催化過(guò)程的全局效率主要受兩個(gè)因素影響：即(1)酶催化劑和化學(xué)催化劑的固有活力與(2)酶催化過(guò)程與化學(xué)催化過(guò)程間的底物傳遞(反應(yīng)物，中間產(chǎn)物或副產(chǎn)物)。構(gòu)建酶-化學(xué)偶聯(lián)催化系統(tǒng)的難點(diǎn)在于酶催化與化學(xué)催化反應(yīng)條件不同，兩種催化劑直接接觸會(huì)引起催化劑中毒或失活，如酶催化劑的構(gòu)象易受化學(xué)催化劑破壞。開(kāi)發(fā)與酶催化劑兼容性強(qiáng)的化學(xué)催化劑可在一定程度保持酶活性。然而，該方法通常僅適用于少數(shù)酶催化劑。為此，研究者利用微囊膜或電解池空間分隔酶催化劑與化學(xué)催化劑，提升二者相容性。但并未考慮催化過(guò)程間物質(zhì)傳輸。而這一點(diǎn)恰恰也是影響酶-化學(xué)偶聯(lián)催化過(guò)程全局效率的關(guān)鍵。理論上講，在酶催化劑與化學(xué)催化劑間構(gòu)建底物通道可促進(jìn)物質(zhì)傳遞，提升全局效率。遺憾的是，同時(shí)協(xié)調(diào)酶催化劑與化學(xué)催化劑間相容性和物質(zhì)傳遞以構(gòu)建酶-化學(xué)偶聯(lián)催化系統(tǒng)的策略鮮有報(bào)道。
生物體精巧的結(jié)構(gòu)使其在進(jìn)行復(fù)雜多催化過(guò)程時(shí)仍保持著高效的物質(zhì)交換速率。在光合作用光反應(yīng)中，水氧化和NADPH再生反應(yīng)分別發(fā)生在類(lèi)囊體膜的囊腔和基質(zhì)側(cè)。析氧反應(yīng)中心Mn4CaO5在囊腔側(cè)首先將水分解為氧氣、質(zhì)子和電子。質(zhì)子和電子經(jīng)過(guò)跨膜運(yùn)輸傳遞到基質(zhì)側(cè)參與由鐵氧還蛋白-NADP還原酶(FNR)催化的NADPH再生反應(yīng)。電子通過(guò)Z-Scheme電子傳遞鏈，經(jīng)光系統(tǒng)II，細(xì)胞色素和光系統(tǒng)I傳遞到FNR；同時(shí)，“質(zhì)子泵”ATP合成酶將質(zhì)子從囊腔側(cè)運(yùn)輸?shù)交?cè)，為NADPH再生提供質(zhì)子源。將水氧化和NADPH再生過(guò)程進(jìn)行“隔室化”避免了高活性反應(yīng)中心Mn4CaO5和FNR接觸而引起的失活。電子和質(zhì)子通道則保證了NADPH再生過(guò)程的能量和物質(zhì)供給。相容性和能量/物質(zhì)傳遞的協(xié)同強(qiáng)化確保了光反應(yīng)過(guò)程的高效、持續(xù)進(jìn)行。
受光合作用光反應(yīng)作用機(jī)制啟發(fā)，我們提出了“隔室化-通道化”策略來(lái)構(gòu)建酶-化學(xué)偶聯(lián)催化系統(tǒng)，以協(xié)調(diào)催化劑相容性和催化過(guò)程的物質(zhì)傳遞(ACS Catal. 2020, 10, 9664)。金屬有機(jī)框架(MOFs)因具有可設(shè)計(jì)的結(jié)構(gòu)單元、豐富的配位位點(diǎn)、開(kāi)放的框架結(jié)構(gòu)和埃及孔道尺寸，已被廣泛應(yīng)用于固定化酶領(lǐng)域。此外，MOFs材料在構(gòu)建復(fù)雜催化系統(tǒng)方面也很有潛力。酶催化劑和化學(xué)催化劑的“隔室化”可由框架結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)，小分子底物的“通道化”則可通過(guò)調(diào)節(jié)孔道尺寸實(shí)現(xiàn)。本研究選擇L-氨基酸氧化酶(LAAO)催化氨基酸氧化和Pt催化H2O2降解反應(yīng)來(lái)構(gòu)建酶-化學(xué)偶聯(lián)催化系統(tǒng)。LAAO主要用于催化氨基酸氧化生成α-酮酸。然而，催化過(guò)程的副產(chǎn)物H2O2會(huì)引起α-酮酸脫羧過(guò)氧化，從而降低目標(biāo)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率。由于其生物毒性，H2O2的累積也可能導(dǎo)致酶失活。Pt納米顆粒是促進(jìn)H2O2分解的高效化學(xué)催化劑。將Pt納米顆粒與LAAO偶聯(lián)，可以消除H2O2以實(shí)現(xiàn)α-酮酸的持續(xù)合成。本研究選用UiO-66作為載體，構(gòu)建了內(nèi)負(fù)載Pt納米顆粒-外吸附LAAO酶-化學(xué)偶聯(lián)催化劑Pt@UiO@LAAO(PUL)。其中，UiO-66的固有孔(0.8 nm和1.4 nm)可實(shí)現(xiàn)兩種催化劑分隔，同時(shí)確保底物H2O2在孔道內(nèi)的自由擴(kuò)散。通過(guò)對(duì)Pt納米顆粒的位置和負(fù)載量進(jìn)行調(diào)控，實(shí)現(xiàn)了催化劑間相容性和物質(zhì)傳遞的協(xié)同強(qiáng)化，獲得了99.7%的α-酮酸收率，較游離LAAO高出2倍以上(41.2%)。
圖1. 酶-化學(xué)偶聯(lián)催化合成α-酮酸示意圖。
采用溶劑熱法合成了Pt@UiO@LAAO酶-化學(xué)偶聯(lián)催化劑，通過(guò)TEM mapping、HRTEM和CLSM(SI)等表征證明了內(nèi)負(fù)載Pt納米顆粒與外吸附L-氨基酸氧化酶。
圖2. (a)Pt@UiO@LAAO (PUL) 制備過(guò)程示意圖；(b-e)PUL催化劑元素分布；(f-g)PUL催化劑邊緣和中心TEM照片。(h-i)PUL催化劑SEM照片。
PUL催化L-谷氨酸轉(zhuǎn)化為吲哚-3-丙酮酸：L-氨基酸氧化酶首先將L-谷氨酸轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)亞氨基酸，同時(shí)產(chǎn)生副產(chǎn)物H2O2，亞氨基酸經(jīng)無(wú)酶水解反應(yīng)生成吲哚-3-丙酮酸；Pt納米顆粒催化H2O2分解，防止其氧化吲哚-3-丙酮酸脫羧生成吲哚-3-乙酸。
圖3. (a)PUL催化合成α-酮酸過(guò)程示意； UiO@LAAO、PUL、UiO@Pt-LAAO和游離LAAO催化合成α-酮酸(b)隨時(shí)間收率以及(c)初始反應(yīng)速率與產(chǎn)率對(duì)比。
PUL催化L-谷氨酸轉(zhuǎn)化為吲哚-3-丙酮酸反應(yīng)效率主要受兩方面影響：(1)LAAO催化L-谷氨酸氧化速率；(2)Pt納米顆粒催化H2O2分解速率。基于此，本研究測(cè)試了對(duì)應(yīng)催化劑的H2O2分解速率，并通過(guò)圓二色譜圖分析了酶催化劑與化學(xué)催化劑發(fā)生相互作用后的構(gòu)象變化，以分析酶催化反應(yīng)的本征速率。在PUL催化劑中，“通道化”可滿(mǎn)足H2O2在UiO孔道內(nèi)的自由擴(kuò)散，“隔室化”則阻止了LAAO與Pt納米顆粒的直接接觸，以保持LAAO活力在較高水平。
圖4. (a)Pt@UiO、UiO@Pt和Pt催化H2O2降解活性；(b)LAAO和Pt處理過(guò)LAAO圓二色譜圖；游離LAAO和LAAO與UiO、Pt@UiO或UiO@Pt孵化4小時(shí)后的(c)圓二色譜圖及(d)對(duì)應(yīng)二級(jí)結(jié)構(gòu)含量圖。
通過(guò)調(diào)控Pt納米顆粒的負(fù)載量和位置，實(shí)現(xiàn)了LAAO催化L-谷氨酸氧化速率和Pt納米顆粒催化H2O2分解速率的匹配，吲哚-3-丙酮酸收率最高達(dá)99.7%(5小時(shí))。并通過(guò)系列圓二色譜圖，對(duì)LAAO失活機(jī)理進(jìn)行了推測(cè)。Pt納米顆粒具有強(qiáng)質(zhì)子親和性，易與LAAO外部肽鏈形成氫鍵，促使LAAO外部α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角打開(kāi)；被打開(kāi)的肽鏈重新通過(guò)側(cè)鏈氫鍵連接形成β-折疊。在LAAO中，在FAD結(jié)合區(qū)和螺旋區(qū)域間的疏水通道連接著底物反應(yīng)腔室與外部環(huán)境，用于將O2從LAAO外部運(yùn)輸?shù)交钚晕稽c(diǎn)。α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)的破壞可能會(huì)造成O2運(yùn)輸通道的損壞，使FADH-2無(wú)法被氧化為FAD，終止了氨基酸氧化反應(yīng)。
圖5.(a)高Pt和低Pt負(fù)載量PUL示意圖；(b)PUL(0.01)、PUL(0.1)、PUL(1)和PUL(5)催化合成IPA隨時(shí)間收率及(c)Pt@UiO(0.01)、Pt@UiO(0.01)、Pt@UiO(1)和Pt@UiO(5)催化H2O2降解活性；(d)PUL(0.01)、PUL(0.1)、PUL(1)和PUL(5)催化合成IPA初始反應(yīng)速率；游離LAAO和LAAO與Pt@UiO(0.01)、Pt@UiO(0.01)、Pt@UiO(1)和Pt@UiO(5)孵化后的(e)圓二色譜圖及(f)對(duì)應(yīng)二級(jí)結(jié)構(gòu)含量圖。
本研究工作由天津大學(xué)姜忠義教授、石家福副教授團(tuán)隊(duì)完成，得到了新南威爾士大學(xué)梁康研究員的指導(dǎo)和幫助。該團(tuán)隊(duì)長(zhǎng)期致力于生物催化、酶-光(化學(xué))偶聯(lián)催化等研究，曾將“隔室化-通道化”策略成功應(yīng)用于多酶催化系統(tǒng)構(gòu)建和應(yīng)用過(guò)程(Adv. Funct. Mater. 2013, 23, 1450; ACS Catal. 2014, 4, 962; Chem. Soc. Rev. 2018, 47, 4295)。目前，團(tuán)隊(duì)正致力于將該思想拓展至酶-光偶聯(lián)人工光合過(guò)程，并已取得積極進(jìn)展。在研究過(guò)程中得到了國(guó)家自然科學(xué)基金(21621004，21776213)，天津市自然科學(xué)基金(19JCYBJC19700)，天津市合成生物技術(shù)創(chuàng)新能力提升行動(dòng)項(xiàng)目(TSBICIP-KJGG-003)，化學(xué)工程聯(lián)合國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金(SKL-ChE-19B01)和生化工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金(2020KF-06)的支持。
ACS Catal. 2020, 10, XXX, 9664–9673
Publication Date: July 29, 2020
https://doi.org/10.1021/acscatal.0c01985
Copyright ? 2020 American Chemical Society
