中國科學院上海有機化學研究所劉文課題組一直致力于2,2’-聯(lián)吡啶類抗生素Caerulomycin (CAE)和Collismycin (COL)的生物合成研究，他們通過基因挖掘技術(shù)克隆了這兩種天然產(chǎn)物的生物合成基因簇，發(fā)現(xiàn)這兩種天然產(chǎn)物的聯(lián)吡啶骨架由極為相似的聚酮-非核糖體聚肽雜合酶 （polyketide synthase-nonribosomal peptide synthetase hybrid, PKS-NRPS)合成，確定了兩種化合物的生物合成前體（J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 9038–9041）并解析了兩種天然產(chǎn)物重要的骨架后修飾生物合成反應（Org. Biomol. Chem.2017, 15, 5472–5475; Synth. Syst. Biotechnol. 2017, 2, 137–146.)。近期，該團隊通過詳盡的體內(nèi)和體外研究，解析了PKS-NRPS裝配線合成2,2’-聯(lián)吡啶核心結(jié)構(gòu)的生物合成機制：該聯(lián)吡啶核心環(huán)的形成需要新穎的黃素蛋白和裝配線上特殊的縮合功能域C（縮合功能域）、Cy（縮合環(huán)化功能域）和Ct（末端縮合功能域）共同參與，完成C-N鍵、C-C鍵的形成以及選擇性的C-S鍵斷裂獲得脫硫（CAE）或者不脫硫（COL）的2,2’-聯(lián)吡啶核心結(jié)構(gòu)（Nat. Commun. 2021, 12, 3124)。聚酮合酶 (polyketide synthase, PKS) 和非核糖體聚肽合成酶 (nonribosomal peptide synthetase, NRPS)合成了為數(shù)眾多的聚酮，聚肽，和聚酮-聚肽雜合的天然產(chǎn)物，其中大量化合物已作為臨床藥物使用，例如抗感染的紅霉素，治療癌癥的博來霉素，對抗器官移植后免疫排異反應的雷帕霉素和他克莫司等。在生物合成上，這兩類酶一般使用多模塊的線性流水線的方式合成化合物骨架：各模塊由基本的底物上載功能域，底物掛載功能域和縮合功能域組成，底物中間體以共價鍵形式與底物掛載功能域相連并逐步經(jīng)各模塊延伸得到長鏈，最終由鏈解離功能域作用成環(huán)或成為自由長鏈。除基本的底物上載和鏈延伸的反應外，中間體還可能發(fā)生多樣的修飾反應并反映在最終的結(jié)構(gòu)多樣性中。由于這種模塊化的線性生物合成，PKS和NRPS被視為具有極大的工程化改造潛力，以合成天然產(chǎn)物類似物和從頭設(shè)計的化合物。除常見的氧化還原，脫水，甲基轉(zhuǎn)移等反應外，PKS和NRPS上還存在較為復雜并多樣化的修飾反應，由于體系的復雜性及技術(shù)難度，還沒有得到充分表征。這些修飾反應常合成獨特的有應用價值的化學結(jié)構(gòu)，對其生物合成機制的解析將拓寬PKS和NRPS的合成生物學的應用。因此，本研究不僅解釋了CAE和COL這兩種具有藥用價值天然產(chǎn)物的生物合成途徑，而且解析了的PKS-NRPS經(jīng)復雜的裝配線上修飾反應合成2,2’-聯(lián)吡啶這一應用廣泛的結(jié)構(gòu)單元的機理，為相關(guān)的合成生物學應用奠定了基礎(chǔ)。
在本工作中，基于前期研究，該團隊推測CAE核心聯(lián)二吡啶結(jié)構(gòu)由CaeA1、CaeA2和CaeA3蛋白構(gòu)成的PKS-NRPS途徑合成，但是在體外重構(gòu)時，發(fā)現(xiàn)單純加入上述的裝配線蛋白和必需的底物分子吡啶甲酸、丙二酰CoA、半胱氨酸和異亮氨酸并不能重構(gòu)核心聯(lián)吡啶中間體（1）,只有額外加入黃素蛋白CaeB1時才能成功重構(gòu)。由此，確定黃素蛋白CaeB1參與了核心吡啶環(huán)的形成。然后，根據(jù)對PKS-NRPS蛋白識別的底物分析，該團隊推測該黃素蛋白參與了聯(lián)吡啶在PKS-NRPS雜合蛋白CaeA2上的形成。然而，正如前所述，PKS和NRPS中的所有反應中間體均共價連接于巨大的多功能域蛋白的載體蛋白功能域 （CP）上，因此一般的生物合成研究方法如游離中間體表征和活性測試等技術(shù)均不適用于該類反應機制的研究。為捕捉相關(guān)反應中間體，劉文團隊發(fā)展了一種基于蛋白質(zhì)組學的方法來檢測PKS和NRPS裝配線蛋白上中間體檢測的方法：經(jīng)以提高相關(guān)中間體檢測靈敏度為目的工程化改造的CaeA2蛋白經(jīng)胰酶-糜酶酶解和質(zhì)譜分析后，結(jié)合多種蛋白質(zhì)組學軟件對數(shù)據(jù)進行處理最終獲得所有的載體蛋白功能域上的中間體信息。通過這套檢測方法，該團隊發(fā)現(xiàn)黃素蛋白CaeB1作用的底物是CaeA2-的肽載體蛋白功能域（PCP）上掛載的半胱氨酸，并且CaeB1要發(fā)揮功能需要通過CaeA2末端的Ct功能域進行招募。Ct通過蛋白質(zhì)相互作用將CaeB1招募到裝配線上，CaeB1再催化PCP上的半胱氨酸氧化脫氫，獲得PCP連接的脫氫半胱氨酸。進一步，Cy功能域催化脫氫半胱氨酸與上游NRPSCaeA1-PKS CaeA2縮合獲得的酰基底物進行C-C鍵連接，獲得線性中間體（12），再脫硫、環(huán)化或者直接環(huán)化形成C-N鍵獲得CaeA2蛋白上掛載的聯(lián)吡啶中間體。該中間體進一步能被CaeA3或者ColA3蛋白識別和亮氨酸縮合形成CAE或者COL生物合成途徑的中間體（1）和（15），其中A3蛋白的C功能域起到門控的作用，特異性地識別脫硫（CaeA3）或者不脫硫（ColA3）的聯(lián)吡啶中間體進行后續(xù)延伸,修飾獲得CAEs或者COLs。
在上述的研究中，作者發(fā)現(xiàn)了NRPS裝配線上縮合功能域的3個新功能：首次報道了Ct功能域具有招募黃素蛋白的招募功能，這是繼糖肽類抗生素中X功能域招募P450外的第二例裝配線上招募蛋白的報道。此外，驗證了Cy功能域除了催化常規(guī)C-N鍵的功能外，還能催化C-C鍵的形成；以及通過A3蛋白C功能域的門控功能，決定了聯(lián)吡啶或者巰基聯(lián)吡啶在后續(xù)轉(zhuǎn)化中的命運。該工作加深了對裝配線上修飾化學的理解，增加了催化功能域的功能多樣性，為進一步拓寬PKS和NRPS的合成生物學應用提供了理論基礎(chǔ)。
劉文課題組龐博博士（現(xiàn)為加州大學伯克利分校助理科學家），上海精準醫(yī)學研究院廖日晶博士和劉文課題組湯志軍博士為本文的共同第一作者。該工作得到了國家自然科學基金委、中國科學院、上海有機所的大力資助。
