眾所周知，羰基通常不存在于蛋白質(zhì)中的，但當在蛋白質(zhì)中引入該基團時，可以讓蛋白質(zhì)獲得額外的反應(yīng)性，這在化學生物學中已被證明是廣泛有用的。然而在蛋白質(zhì)中產(chǎn)生羰基的方法依賴于帶有羰基的非天然氨基酸的共轉(zhuǎn)化摻入或現(xiàn)有天然氨基酸的氧化轉(zhuǎn)化(化學或酶促)。但是利用蛋白質(zhì)中碳碳鍵直接獲得羰基的方法卻少有報道，如果可行的話，通過c-c鍵形成羰基化直接添加C=O基團的替代策略，將為增加有價值的反應(yīng)性和擴展蛋白質(zhì)中可能的功能提供強有力的方法。基于此，今日分享來自大不列顛及北愛爾蘭聯(lián)合王國牛津大學化學系Benjamin G. Davis等研究人員的成果Residue-Selective Protein C-Formylation viaSequential Difluoroalkylation-Hydrolysis，該論文發(fā)表在ACS Cent. Sci.上。
首先作者對最近提出的利用自由基來克服水中碳正離子或碳當量不適當?shù)膯栴}來合成碳碳的方法進行剖析，設(shè)想一種可以直接將蛋白質(zhì)中碳氧鍵演變成羰基的方法。但是，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，該策略過于復(fù)雜，結(jié)合之前工作的發(fā)現(xiàn)，一些天然蛋白殘基會與CF3?自由基發(fā)生反應(yīng)，而CF3?自由基似乎位于適合某些芳香族蛋白殘基（主要是Trp）的反應(yīng)尖端。但由于天然殘基常是惰性的，對其他碳自由基而言要求蛋白質(zhì)中存在更多活性(非天然)自由基受體殘基以形成碳碳鍵。但是作者未能直接合成有效的RC（O）?自由基，用于蛋白質(zhì)的直接反應(yīng)（圖2b）。隨后，作者根據(jù)研究其他含蛋白質(zhì)的二氟烷基自由基的過程中發(fā)現(xiàn)可以在溫和的條件下產(chǎn)生HCF2?且其對天然殘基具有充分的反應(yīng)性，同時還發(fā)現(xiàn)通過其固有的化學選擇性與雜芳族殘基(X = Trp > His，圖2c)加合物中的Reimer-Tiemann水解偶聯(lián)的反應(yīng)性。
所以作者考慮了一種間接的方法，即有效地利用二氟甲基自由基作為掩蓋的“ HC（O）?等效物”，用于蛋白質(zhì)C-甲?；▓D2c）。所得的非蛋白殘基C-甲?；?Trp（Cfw）因此在C2處具有最小尺寸的反應(yīng)基團。隨后，作者證明了該基團可用于蛋白質(zhì)中的選擇性親電子羰基介導的修飾以及用作增強的熒光團。
圖2 蛋白質(zhì)C-羰基化的潛在化學策略分析
接著就是，作者提出一種反向過程(從“CF2”: RCF2→RC(O)或HCF2→HC(O))來獲得RC（O）?或HC（O）?等效物。方法是在水性條件下和有利于水解的電子環(huán)境(例如芐基)中適當定位二氟亞甲基前體。雖然CF2部分在飽和位置通常是穩(wěn)定的，但是在(雜)芳烴中芐基或等效位置發(fā)現(xiàn)的鹵代烷基部分可能更容易通過Reimer-Tiemann水解。
作者從測試合適的二氟烷基RCF2·自由基開始，經(jīng)過系統(tǒng)性的探索測試，發(fā)現(xiàn)2-吡啶基砜支架（RCF2SO2py1，圖3a）在通常用于蛋白質(zhì)操作和反應(yīng)的水性反應(yīng)緩沖液中顯示出有用的溶解性和良好的穩(wěn)定性。以Ru(bpy)32+為光催化劑，通過光催化還原砜來引發(fā)自由基，對一系列可能的電子供體中的測試中發(fā)現(xiàn)，含水緩沖液中的抗壞血酸鈉被證明對這些反應(yīng)最有效。然而，在細胞應(yīng)用中，發(fā)現(xiàn)使用非抗壞血酸條件確實取得了部分成功，這表明某些細胞存在的內(nèi)源性生物反應(yīng)物也可能代替抗壞血酸發(fā)揮作用。后在模擬典型蛋白質(zhì)修飾方案的條件下（低標度/濃度，氨基酸殘基作為限制性底物與過量的其他反應(yīng)物），通過使用15N標記標準物的定量LC-MS監(jiān)測顯示Trp底物具有更高的反應(yīng)活性，并在隨后實驗中證實，HCF2自由基對Trp底物具有殘基選擇性的二氟甲基化，產(chǎn)生的C-2-二氟甲基化Trp殘基經(jīng)歷Reimer-Tiemann型脫鹵作用，使蛋白質(zhì)水解折疊成2-甲?；鵗rp (Cfw)。
圖3 還原引發(fā)的二氟甲基化作用范圍
然后，作者在確定了模型殘基中由Trp產(chǎn)生Cfw的潛在生產(chǎn)性和選擇性流形之后，我們在肽類環(huán)境中測試這種潛在的反應(yīng)性，即在多肽中進行了HC(O)?當量的測試。作者構(gòu)建了兩種短模型多肽底物：一種底物包含代表性的潛在蛋白原性芳香和/或親核殘基，KFWAWH中假定的競爭性反應(yīng)位點（Phe，His和Lys以及Trp）以及相應(yīng)的無Trp （Trp→Met，Tyr）發(fā)現(xiàn)“突變體”KFMAYH具有反應(yīng)比較所需的最相似溶解度。為了分析反應(yīng)混合物，作者采用了LC-MS和LC-MS / MS監(jiān)測，并輔以數(shù)據(jù)依賴采集，以確保通過不斷發(fā)展的中間體和產(chǎn)物的片段化來進行無偏分析。隨后驗證了從Trp到Cfw的二氟烷基化/水解序列的實用性，開發(fā)了針對Cfw單殘基設(shè)計的MS可檢測化學衍生方法（見圖4）。
圖4 肽中從Trp到Cfw的二氟烷基化/水解序列的驗證。產(chǎn)物的合成TIC-MS光譜對比分析
在肽系統(tǒng)中證明了所需的反應(yīng)性、位點選擇性和水解Reimer-Tiemann成功能夠使Trp選擇性轉(zhuǎn)化為Cfw后，作者開始研究蛋白質(zhì)底物（圖5）。選擇馬心臟肌紅蛋白，在11個His、7個Phe和2個Tyr殘基中含有兩個Trp殘基（Trp7和Trp14），因此可作為評估C-甲酰化序列化學選擇性的良好試驗（二氟甲基化水解，圖5a，左中）。完整的蛋白質(zhì)LC-MS驗證產(chǎn)物的成功形成，其質(zhì)量與二氟甲基化相對應(yīng)，部分是表面水解的物種（圖5a，左圖）。作者利用胰蛋白酶消化評估反應(yīng)的選擇性，并通過LC-MS/MS分析所得肽。接下來作者測試了蛋白質(zhì)底物范圍。得到的標準條件可普遍適用于其他具有不同Trp含量（1-6個殘基）和折疊狀態(tài)（主要是α結(jié)構(gòu)蛋白肌紅蛋白；兩種混合的α/β結(jié)構(gòu)域蛋白溶菌酶和乳清蛋白以及主要的β結(jié)構(gòu)蛋白胰蛋白酶）導致基本相似的良好二氟甲基化水平（全部轉(zhuǎn)化率>60%，圖5b）。最后，對于肽，在沒有光催化劑或光的情況下，二氟甲基化不進行。
圖5 連續(xù)的二氟烷基化水解可以獲得蛋白質(zhì)中的Cfw
隨后，作者在蛋白質(zhì)中對其化學選擇性和熒光光譜進行了探究。將Cfw作為一種新的殘基安裝到潛在的反應(yīng)位點中，增加了通過醛化甲?；鶎崿F(xiàn)多種親電“捕獲”模式的可能性，這種模式可以補充和擴展其他反應(yīng)模式。通過氘化物添加（使用NaBD4），Cfw在蛋白質(zhì)中的明顯和清晰的反應(yīng)性已經(jīng)得到證實，其效率大于90%。并對廣泛有效使用的α-親核試劑進行了測試，發(fā)現(xiàn)Cfw顯示出明顯的強固有反應(yīng)性，并且只有在少數(shù)情況下需要連接催化劑。以這種方式，攜帶Cfw的蛋白質(zhì)可以容易地用適合于19F NMR的19F標記物（圖5c）進行標記。同時，還測試了Cfw中醛反應(yīng)的第三種模式。含eqMyo的Cfw與一系列苯胺和烷基胺進行了現(xiàn)成的還原胺化反應(yīng)，使用NaBH3CN作為二氟甲基化水解標記序列的一部分，使Cfw的轉(zhuǎn)化率達到未優(yōu)化的85%。
為了直接在含Cfw的蛋白質(zhì)中檢測這種紅移的自體熒光，作者使用寬范圍的紫外光透照（λmax=302nm），在高于天然Trp熒光發(fā)射波長（>480nm）的波長處進行檢測。只有含有Cfw的樣品顯示出光發(fā)射（圖5d）。
最后，作者測試了在細胞環(huán)境中的應(yīng)用（圖6）。采用熒光相關(guān)細胞分選（FACS）分析來鑒定那些在Cfw形成的發(fā)射頻率下具有增強熒光的細胞（～450 nm）。應(yīng)用于人類T淋巴細胞（Jurkat）細胞的二氟甲基化/水解反應(yīng)允許在二氟甲基化反應(yīng)時間過程（<90 s）下鑒定條件，該時間過程允許在隨后的水解處理后在活細胞中顯著誘導熒光（見圖6a）。雖然延長二氟甲基化反應(yīng)時間導致細胞相關(guān)熒光增加，但也導致細胞活力降低。此外，與Cfw形成一致，在更高溫度下對反應(yīng)的“甲?；奔毎M行水解處理后，觀察到相關(guān)的熒光水平增加（見圖6b），類似于在體外對蛋白質(zhì)進行的觀察。
圖6 白血病人T淋巴細胞（Jurkat）細胞的二氟甲基化/水解和熒光活化分選
所以，作者通過開發(fā)在抗壞血酸鹽存在下的還原性光催化蛋白質(zhì)修飾可以有效地產(chǎn)生HCF2自由基，從而產(chǎn)生對Trp具有殘基選擇性的二氟甲基化；產(chǎn)生的C-2-二氟甲基化Trp殘基經(jīng)歷Reimer-Tiemann型脫鹵作用，使蛋白質(zhì)水解折疊成2-甲?；鵗rp (Cfw)。這種自由基加成-水解方案現(xiàn)在允許對蛋白質(zhì)中的醛進行直接規(guī)?；幕瘜W處理，允許其在已建立的醛標記和連接化學(腙連接、肟連接、還原性胺化、還原性氘化)中快速開發(fā)，同時具有新的位點(Trp)選擇性。
【文章鏈接】https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acscentsci.0c01193
【D O I】https://dx.doi.org/10.1021/acscentsci.0c01193
