Formicamycins和fasamycins是典型的聚酮類天然產物，具有顯著的抗菌活性。本文揭示fasamycins需兩步途徑(擴環(huán)與縮環(huán))轉化為formicamycins，涉及兩個基因，forX和forY。敲除forX，只產fasamycin E，敲除forY，產生一些新的Baeyer-Villiger氧化型的內酯類中間體，說明ForX作為Baeyer-Villiger單氧化酶可使fasamycins的C環(huán)去芳構化。通過體內交叉喂養(yǎng)以及生物仿生半合成實驗，作者發(fā)現這些內酯類產物在ForY的催化下以特殊的還原縮環(huán)反應形成formicamycins。
微生物芳香聚酮類化合物是生物合成相關分子中的大家族之一，結構多樣且具有顯著的生物活性，如已應用于臨床的四環(huán)素類抗生素，蒽環(huán)類抗腫瘤藥。其結構多樣性主要通過后修飾酶引入，如酰化，烷基化，糖基化，鹵化以及氧化還原，也可由氧化還原酶催化C-C鍵斷裂，重排使結構更復雜化，如jadomycins，gilvocarcins以及chartreusins生物合成途徑中的黃素依賴的Baeyer-Villiger (BV) 單氧化酶。 Fig.1 Chemical skeletons of 1-21and 2D NMR structers determination of 18. Fig.2 Comparison of the fasamycin/formicamycin biosynthetic gene clusters. 由以上生信分析以及實驗結果指導，作者分別通過cas9介導的基因編輯同框敲除forX，forY，敲除forX，只形成fasamycin E (3, fig.3c)，這一點證實ForX在formicamycin生物合成中發(fā)揮氧化功能，并且以鹵化的fasamycin為底物。敲除forY，產生6個新化合物17-22(fig.1，fig.3d)。通過與已知化合物3的ESI-MS，UV對比，以及2D NMR，確定17-21的結構。這些結果說明fasamycins轉化為formicamycins需要經過由ForX催化fasamycin類底物進行Baeyer-Villiger反應的擴環(huán)和ForY催化Baeyer-Villiger中間體進行兩電子還原以及C19位氫化物加成的縮環(huán)反應。為了證實以上結論，作者試圖體外表達上述兩個蛋白，很不幸未能獲得可溶性蛋白，因此進行仿生化學合成法研究生物合成途徑，向敲除forX的S. formicae 培養(yǎng)液中添加化合物18，9天后產生formicamycin同源物5，8，9，13，19，這一點與18是formicamycins的直接中間體以及ForY的潛在底物相一致。 Fig. 3 Mutational analysis of the tailoring enzyme encoding genes involved in formiacamycin biosynthesis. (a) S. formicae wild type; (b) S. formicae▲forV; (c)S. formicae ▲forX; (d)S. formicae ▲forY. 為了模仿ForY催化的生物合成轉化，作者使用硼氫化鈉還原化合物19（fig.4），得到4個化合物(23-26)，其中23和24是兩對具有formicamycin環(huán)結構的（10RS, 19RS）非對映異構體，UPLC分析(fig.5)得出二者的非對映過量值分別為41.3%和40.5%；25是C10-C19位雙鍵還原的內酯，沒有發(fā)生通過縮環(huán)進行的重排；NMR, MS顯示26為C11位脫氧化的19。 對于芳環(huán)系統脫芳構化在天然產物中已有報道，如缺失agnestins和cryptosporioptides中可能編碼Baeyer-Villiger酶的基因，會有芳香前體的富集。對于ForX的Baeyer-Villiger活性，作者認為可能存在兩種途徑（fig.6）。在第一種途徑中，過氧黃素作為親電試劑將氧引入到C10位形成叔羥基，然后對相鄰苯酚去質子化。隨后隨著鍵遷移以及C20位質子化發(fā)生重排。在第二種途徑中，ForX可能通過底物結合首先誘導環(huán)C自發(fā)互變異構，隨后將過氧黃素中的質子轉移到C9羰基上產生氧鎓中間體，然后黃素過氧陰離子隨后在經典BV-樣反應中作為親核試劑產生內酯中間體。作者認為途徑I更適合，通過次氯酸介導依賴于黃素的鹵化酶將親核氯離子轉化為高反應性的親電試劑，這一點是與ForX是Group A單氧化酶催化羥基化反應相一致。 Fig.5 UPLC-UV analysis for the reduction products 23 and 24. 作者猜測ForY隨后作為黃素依賴的還原酶催化內酯中間體兩電子還原，這個反應可能是氫離子通過1,4-共軛進攻C19位形成烯醇27。隨后烯醇式隨著C9-C10 sigma 鍵以及一個環(huán)氧化物中間體的形成而破壞，隨后的重排可產生具有總環(huán)收縮的C10叔羥基，這一反應讓人聯想到 Favorskii反應。此途徑與硼氫化鈉還原反應形成的副產物以及C9-C10鍵形成過程中軌道重疊所需的立體空間相一致。Favorskii類反應在自然界中很罕見，在聚酮天然產物enterocin中曾有報道，該途徑涉及通過雙4-電子氧化激活前一中間體，該反應由一個黃素依賴的單氧化酶EncM催化，該酶利用黃素-N5-氧化物而非過氧黃素中間體催化底物氧化并激化 Favorskii類反應，氧化促進之后的縮醛和雜環(huán)化反應，且由EncM介導。 在formicamycin生物合成途徑中，只產生單一立體構型的產物而非如同過硼氫化鈉反應所產生的產物，說明ForY必定既控制立體化學也限制反應協同物的產生。由ForY催化的還原環(huán)縮合在聚酮生物合成過程中非常特別，基因組分析沒有搜索到類似BGC，說明該途徑是formicamycin生物合成過程中特有的。
Fig. 6 The alternative pathways for each step of the proposed two-step ring expansion-contraction mechanism of formicamycin biosynthesis from fasamycin E.
來源：遇見
