盡管自然界中的碳水化合物和糖復(fù)合物結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜，但人的糖蛋白和糖脂僅有九種構(gòu)成單元：葡萄糖（glucose, Glc）、半乳糖（galactose, Gal）、N-乙酰氨基葡萄糖（N-acetylglucosamine, GlcNAc）、N-乙酰氨基半乳糖（N-acetylgalactosamine, GalNAc）、葡萄糖醛酸（glucuronic acid, GlcA）、木糖（xylose, Xyl）、甘露糖（mannose, Man）、巖藻糖（fucose, Fuc）和N-乙酰神經(jīng)氨酸（N-acetylneuraminic acid, Neu5Ac）（如圖1）[1]。這些構(gòu)成單元必須被活化為糖核苷酸后，才能參與到不同糖鏈的構(gòu)建中[2, 3]。糖核苷酸在結(jié)構(gòu)上可分為兩類：核苷二磷酸（nucleoside diphosphate, NDP）糖和核苷一磷酸（nucleoside monophosphate, NMP）糖，其中NDP-糖最為常見。尿苷二磷酸（uridine diphosphate, UDP）單糖是最常見的NDP-糖供體，在多糖生物合成途徑中，它們能夠被糖基轉(zhuǎn)移酶或者合酶轉(zhuǎn)移到糖基受體上構(gòu)建糖苷鍵。天然和非天然UDP-糖都能夠通過化學(xué)、酶法和化學(xué)酶法來合成[4-7]。雖然已有很多文獻(xiàn)報道了天然UDP-糖的合成方法，但是目前針對非天然UDP-糖的合成和應(yīng)用的探索還相對匱乏。這些非天然糖基供體有很大的應(yīng)用前景，可作為酶底物用于功能性多糖和糖復(fù)合物的合成、酶抑制劑研究以及各種活性測試[4, 8]。因此，非天然糖核苷酸的合成在過去十年間一直都是研究熱點(diǎn)。Wagner等人總結(jié)了從1999年到2009年NDP-糖、NMP-糖及其衍生物的化學(xué)合成進(jìn)展[4]，Thorson等人在2011年發(fā)表的有關(guān)糖基化的文章中詳細(xì)總結(jié)了糖核苷酸的酶促合成途徑（尤其是包括端基異構(gòu)激酶和焦磷酸化酶的合成方法）及其底物和酶催化的轉(zhuǎn)化[9]。這里，我們總結(jié)了非天然糖核苷酸，特別是尿苷二磷酸乙酰氨基葡萄糖（uridine diphosphate-N-acetylglucosamine, UDP-GlcNAc）/尿苷二磷酸乙酰氨基半乳糖（uridine diphosphate-N-acetylgalactosamine, UDP-GalNAc）類似物的化學(xué)法、酶促法和化學(xué)酶法制備方面的進(jìn)展，及其在生理和藥理學(xué)方面的生物技術(shù)應(yīng)用。由于很難通過修飾天然糖核苷酸來獲得非天然糖核苷酸[4]，目前研究中主要由“兩步法”合成策略來實現(xiàn)非天然糖基供體的合成：第一步是糖-1-磷酸（sugar-1-P）的合成，可以在此階段實現(xiàn)結(jié)構(gòu)的衍生化；第二步是二磷酸鍵的形成。同時，我們也介紹了糖核苷酸在過去十年中的新應(yīng)用，包括碳鏈長度可控多糖的合成，穩(wěn)定的同位素標(biāo)記技術(shù)，酶促和代謝生物正交策略以及結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系（structure activity relationships, SAR）研究等。
1 糖核苷酸的合成
常見的糖核苷酸中的大多數(shù)共有相似的生物合成途徑，即由6-磷酸葡萄糖和6-磷酸果糖作為關(guān)鍵中間體，以激酶和核苷酸轉(zhuǎn)移酶作為關(guān)鍵酶。GlcNAc和GalNAc是很多重要多糖或糖復(fù)合物（比如糖胺聚糖（glycosaminoglycans, GAGs））的基本構(gòu)成單元，所以對它們相應(yīng)的核苷酸供體（即UDP-GlcNAc和UDP-GalNAc）的研究最為廣泛[10,11]。在生物合成途徑中，通常是由酶催化葡萄糖（de novo pathway）或GlcNAc/GalNAc（salvage pathways）生成糖環(huán)1-位單磷酸化的中間產(chǎn)物GlcNAc-1-磷酸（GlcNAc-1-P），再對GlcNAc-1-P進(jìn)行酶促焦磷酸化從而合成二磷酸供體UDP-GlcNAc[12]。UDP-GlcNAc/GalNAc的生物合成也可被進(jìn)一步簡化：用6-激酶將糖轉(zhuǎn)化為的糖-6-P，糖-6-P再經(jīng)變位酶轉(zhuǎn)化為糖-1-P，糖-1-P緊接著被尿苷三磷酸（UTP）焦磷酸化得到UDP-糖（如圖2）[5]。
圖2. UDP-GlcNAc/GalNAc的生物合成途徑
根據(jù)生物合成途徑得知，核苷二磷酸糖合成的關(guān)鍵步驟是在核苷的5'-OH位和糖的異頭羥基之間引入焦磷酸基團(tuán)（如圖3）[4]。目前研究中常用兩種途徑進(jìn)行合成，第一種方法是將含離去基團(tuán)的糖基供體（如鹵化物）和核苷5'-二磷酸直接進(jìn)行糖基化（如圖3，path A）。但這種方法較難控制糖苷鍵的立體選擇性。第二種方法是Khorana和Moffat開發(fā)的，目前更流行（如圖3，path B）：耦合單糖-1-磷酸和活化的核苷5'-單磷酸鹽（如核苷磷酸嗎啡酸鹽）來構(gòu)建焦磷酸鍵，最終產(chǎn)物的糖苷鍵構(gòu)型可以通過糖-1-磷酸的立體選擇性來控制[13,14]。
1.1 α-連接構(gòu)型的糖-1-磷酸的合成
一般而言，控制糖-1-P的立體構(gòu)型，再將其與活化的核苷5'-單磷酸酯偶聯(lián)，可以控制UDP-糖基供體糖環(huán)和焦磷酸部分之間的糖苷鍵構(gòu)型。到目前為止，對α-連接構(gòu)型的糖-1-磷酸的合成方法的研究較為深入。
1.1.1 麥克唐納反應(yīng)（MacDonald reaction）
麥克唐納反應(yīng)是一種用于糖的單磷酸化的經(jīng)典方法，反應(yīng)過程是全乙?；Ｗo(hù)的單糖與磷酸在真空下進(jìn)行的化學(xué)反應(yīng)，以高選擇性生成α-連接構(gòu)型的糖-1-磷酸[15]。在這個反應(yīng)的基礎(chǔ)上，Masuko等人以30%-50%的產(chǎn)率構(gòu)建了一個小型非天然GlcNAc-1-P和GlcNAc-1-P衍生物庫（如圖4）[16]。他們也證實了疊氮基和炔基在這種酸性條件下較穩(wěn)定，因此，可以進(jìn)一步通過點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行熒光基團(tuán)標(biāo)記。UDP-三氟乙酰氨基葡萄糖（UDP-GlcNTFA）是在化學(xué)酶法合成硫酸乙酰肝素和肝素中一種常用的糖基供體，而在麥克唐納反應(yīng)的條件下三氟乙酰氨基也很穩(wěn)定，所以也可以利用該反應(yīng)合成α-連接構(gòu)型GlcNTFA-1-P[17]。該方法也可用于其他糖核苷酸的合成，如α-D-阿拉伯呋喃糖-1-磷酸（α-D-arabinofuranose-1-phosphate, Ara-1-P）[18]、3-脫氧-α-D-阿拉伯己糖-1-磷酸[19]和2-脫氧-α-D-葡萄糖-1-磷酸[19]。然而，麥克唐納反應(yīng)的反應(yīng)條件較為苛刻，一般不適用于熱穩(wěn)定性差的糖的合成，而且其產(chǎn)率普遍偏低，這限制了該方法進(jìn)一步的應(yīng)用[4]。
圖4. 通過麥克唐納反應(yīng)合成GlcNAc/GalNAc-1-磷酸類似物
1.1.2 對半縮醛羥基進(jìn)行磷酸化反應(yīng)
對糖環(huán)半縮醛羥基C-1-OH直接進(jìn)行磷酸化是另一種構(gòu)建α-構(gòu)型糖-1-P的有效方法。半縮醛羥基和磷酸化試劑反應(yīng)后能獲得保護(hù)基保護(hù)的α-構(gòu)型單磷酸，然后經(jīng)過催化加氫即可將磷酸鹽上的保護(hù)基團(tuán)去除，獲得α-連接構(gòu)型糖-1-P。Sabesan和Neira等人通過4-二甲基氨基吡啶（4-dimethylaminopyridine, DMAP）催化糖半縮醛和二苯基膦酰氯耦合構(gòu)建了α-糖苷鍵[20]。Dinev等人用同樣方法制備了13C標(biāo)記的全乙?；咸烟?/span>-1-磷酸，其產(chǎn)率為83%(如圖5-I)[21]。Schultz等人在二異丙基氨基鋰（lithium diisopropylamide, LDA）存在下用四芐基焦磷酸進(jìn)行磷酸化，生成了高α-選擇性的磷酸化產(chǎn)物（如圖5-II）[22,23]。他們發(fā)現(xiàn)氟、疊氮基在這種條件下也很穩(wěn)定，從而可以構(gòu)建氟、疊氮基修飾的非天然糖基供體。Feng等人（如圖5-III）通過三氮唑催化二芐基二乙基胺基膦（dibenzyl N,N-diethylphosphoramidite, DDP）與半縮醛，生成亞磷酸鹽，隨后氧化得到糖-1-P。雖然此反應(yīng)沒有立體選擇性，產(chǎn)物為α，β混合物（α:β=1:1）[24]，但后續(xù)在四氫呋喃中用叔丁基過氧化氫（t-BuOOH）處理這兩種異構(gòu)體時，β-構(gòu)型的產(chǎn)物能快速異構(gòu)化為α-異構(gòu)體。但是，在選擇氧化劑時，如果使用過氧化氫（H2O2），會破壞O-P鍵生成副產(chǎn)物。同樣，Graziani等用雙（芐氧基）-N，N-二異丙基氨基-磷化氫/1H-四唑成功合成了GDP-D-甘油-α-D-甘露庚糖，然后用叔丁基過氧化氫（tert-Butyl hydroperoxide, TBHP）氧化制備了關(guān)鍵的中間體α-磷酸鹽[25]。該方法還可用于合成一系列糖-1-磷酸酯，例如D-甘露糖醛酸（D-mannuronic acid, ManA）-1-P[26]，N-乙?；蛩幔?/span>N-acetylmuramic acid， MurNAc）-1-P[27]，2-脫氧-α-D-葡萄糖-1-P，3-脫氧-α-D-阿拉伯己糖-1-P, α-D-來蘇糖-1-P和4-脫氧-α-D-lyxo-hexose-1-P[19]。
圖5. 糖半縮醛和磷酸化試劑間的縮合生成α-連接異頭磷酸鹽
1.1.3 酶法途徑
由于糖核苷酸在有機(jī)溶劑中的溶解度較低，且糖苷鍵和焦磷酸鍵不耐水解，通過傳統(tǒng)化學(xué)方法合成糖核苷酸非常具有挑戰(zhàn)性。另外，在化學(xué)合成過程中通常涉及多步的保護(hù)基操作和異構(gòu)體分離純化，其過程繁瑣、產(chǎn)率低下。而酶法合成利用了酶催化的高效選擇性，能夠模擬糖苷鍵生物合成途徑，具有高立體選擇性和高區(qū)域選擇性，有廣泛的應(yīng)用前景[5]。NahK（N-acetylhexosamine kinase）是一種N-乙酰己糖胺激酶，也是第一個被報道的野生型葡萄糖型1-激酶，可以快速有效地催化GlcNAc受體和5'-三磷酸腺苷（adenosine triphosphate, ATP）磷酸供體合成GlcNAc-1-P[28]。Zhao和Cai等人利用這種酶成功將非天然的GlcNAc/GalNAc類似物轉(zhuǎn)換成了它們的1-磷酸化產(chǎn)物。并且他們發(fā)現(xiàn)這種酶的底物適用性非常好，無論糖環(huán)的C-4位羥基是平伏鍵或豎立鍵，都不影響酶對底物的識別（如圖6）[29,30]。更重要的是，對糖底物的N-?；M(jìn)行多種正交基團(tuán)的修飾，也不影響酶的識別。因此，通過此方法可以成功將一些正交基團(tuán)標(biāo)記到糖或糖復(fù)合物結(jié)構(gòu)中去，便于進(jìn)一步進(jìn)行生物活性研究。另外，NahK可以與其他兩種酶（Pasteurella multocida N-acetylglucosamine 1-phosphate uridylyltransferasepm, PmGlmU和Pasteurella multocida inorganic pyrophosphatase, PmPpA）結(jié)合使用，從而“一鍋法”合成UDP糖衍生物，大大簡化了合成過程[31]。
圖6. 用NahK酶法合成GlcNAc/GalNAc-1-P衍生物
由于糖環(huán)端基的異構(gòu)效應(yīng)，相比α-構(gòu)型，β-構(gòu)型的吡喃糖磷酸很不穩(wěn)定，所以其合成頗具挑戰(zhàn)性。前面介紹的方法都無法實現(xiàn)β-構(gòu)型的構(gòu)建，目前也很少有文獻(xiàn)報導(dǎo)β-鍵構(gòu)型的糖-1-磷酸的合成。Oberthür等人利用α-構(gòu)型糖基鹵化物和四丁胺鹽之間的SN2取代反應(yīng)合成了β-構(gòu)型2-脫氧糖磷酸(如圖7-I)[32]。他們發(fā)現(xiàn)，更穩(wěn)定的異頭離去基團(tuán)有助于磷酸化反應(yīng)從SN1轉(zhuǎn)換為SN2路徑。同時，鄰近基團(tuán)的參與有助于磷酸化步驟中的立體控制。Timmons等人通過乙?；虮郊?span style="text-indent: 32px; line-height: 20px;">?；Ｗo(hù)的糖基溴化物和磷酸二芐酯的偶聯(lián)，成功合成了β-L-巖藻糖/鼠李糖-1-磷酸(如圖7-II)[33]。Prihar等人用鄰亞苯基氯膦酸將甘露吡喃糖的半縮醛羥基磷酸化，得到β-D-甘露吡喃糖基-1-P[34]。同時，他們還使用MacDonald反應(yīng)獲得了β-和α-L-巖藻呋喃糖-1-磷酸的混合物（β:α=12:5）[35]。此外，酶促途徑也可以實現(xiàn)β-構(gòu)型糖-1-P
