在金屬有機(jī)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，金屬絡(luò)合物催化反應(yīng)的機(jī)理往往不同于生物體內(nèi)金屬催化的反應(yīng)機(jī)理。因此，如果能把非生物體系的催化中間體應(yīng)用到生物體系，那么就能大大擴(kuò)展生物體內(nèi)酶促反應(yīng)的應(yīng)用范圍。為了達(dá)到這個(gè)目標(biāo)，化學(xué)家已經(jīng)發(fā)展了一系列策略，比如酶的定向進(jìn)化及人工金屬酶的設(shè)計(jì)。但是，這些策略應(yīng)用范圍仍然極其有限。作為金屬有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域的一類重要中間體，單核金屬–氫負(fù)中間體能夠參與許多有機(jī)反應(yīng)；但是利用單核金屬–氫負(fù)為反應(yīng)中間體的酶促反應(yīng)在自然界中并不存在。在生物體內(nèi)，與鋅離子協(xié)同催化反應(yīng)的酶非常普遍，其中的碳酸酐酶更是早已被深入研究。簡(jiǎn)單來說，碳酸酐酶是把二氧化碳轉(zhuǎn)化為碳酸，反應(yīng)機(jī)理經(jīng)過了一個(gè)路易斯酸和氫鍵的協(xié)同催化作用以實(shí)現(xiàn)氫氧根對(duì)二氧化碳的加成（圖1a左）。在此背景下，加州大學(xué)伯克利分校的Hartwig課題組設(shè)想如果能把二氧化碳親電試劑換為酮，同時(shí)把被轉(zhuǎn)移的氫氧根換成氫負(fù)離子，那么碳酸酐酶就實(shí)現(xiàn)了對(duì)酮的還原（圖1a右）。同時(shí)考慮到酶促反應(yīng)的手性環(huán)境，該反應(yīng)極有可能會(huì)具有優(yōu)秀的對(duì)映選擇性，這樣就可以在不使用復(fù)雜NADPH復(fù)雜輔基（圖1b）的情況下實(shí)現(xiàn)羰基的酶促不對(duì)稱還原。在此思路引導(dǎo)下，他們發(fā)展了一個(gè)利用硅氫試劑為還原劑，能夠高立體選擇性地還原酮為手性二級(jí)醇的新反應(yīng)（圖1c）。該工作近期發(fā)表在《Nat. Chem.》上。
圖1：研究背景及該文工作。圖片來源：Nat. Chem.在有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域，烷氧鋅或者氟化鋅試劑能夠與硅氫反應(yīng)生成Zn-H中間體。鑒于此反應(yīng)，作者設(shè)想，當(dāng)向碳酸酐酶促反應(yīng)中添加硅氫還原劑時(shí)，原有的烷氧鋅就有可能與硅氫反應(yīng)生成Zn-H中間體。在確定了研究切入點(diǎn)后，作者選擇4–乙?；拎?strong>1為底物，評(píng)估了不同硅氫試劑的還原活性（表1），最終發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用PhSiH3為還原劑時(shí)反應(yīng)效果最好（99%收率，98% e.e.值，entry 1）。對(duì)照反應(yīng)表明，硅氫試劑對(duì)該不對(duì)稱還原反應(yīng)極為重要。把PhSiH3更換為PhMeSiH2時(shí)，雖然對(duì)映選擇性不變，但是反應(yīng)產(chǎn)率降為78%（entry 2）。當(dāng)把把PhSiH3更換為PhMe2SiH、Et3SiH、(Me3SiO)2MeSiH、(iPr)2SiH2時(shí)，反應(yīng)則完全不能發(fā)生（entry 3-7）。不出意外，在無酶參與的條件下，反應(yīng)也不能進(jìn)行（entry 8）。進(jìn)一步的對(duì)照反應(yīng)表明，不同的碳酸酐酶具有不同的催化活性：在各種碳酸酐酶中，hCAII的反應(yīng)活性最高（entry 9-10）。表1：不對(duì)稱還原反應(yīng)的條件優(yōu)化。圖片來源：Nat. Chem.在酶促反應(yīng)研究領(lǐng)域，反應(yīng)中使用的酶往往需要通過蛋白純化技術(shù)得到，但是蛋白提純往往極為耗時(shí)。從實(shí)用性角度來講，如果能直接使用含有目標(biāo)酶的整個(gè)細(xì)胞進(jìn)行催化反應(yīng)，無疑就會(huì)大大提高反應(yīng)效率。所以，作者進(jìn)一步研究了利用含有最優(yōu)碳酸酐酶的整個(gè)細(xì)胞來催化該還原反應(yīng)的可能性（圖2）。如圖2a所示，純化的酶、含有酶的正常整個(gè)細(xì)胞、在零下20 C存放三天的正常整個(gè)細(xì)胞及凍干的含有酶的整個(gè)細(xì)胞都能催化反應(yīng)。雖然不同環(huán)境下的酶都能以高對(duì)映選擇性還原底物，但是在零下20 C存放三天的正常整個(gè)細(xì)胞催化反應(yīng)的產(chǎn)率卻僅有46%，而另外三種條件下的酶都能以95%的收率還原底物酮（圖2a）。隨后，作者選用了含有氘代原子的PhSiD3 作為氫源來參與反應(yīng)。結(jié)果表明，D原子以99%的 比例被引入到還原產(chǎn)物中（圖2b）。為了進(jìn)一步研究該反應(yīng)的實(shí)用性，作者進(jìn)行了放大規(guī)模實(shí)驗(yàn)。在克級(jí)規(guī)模下，標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)底物的產(chǎn)率為93%、e.e. 值為97%（圖2c）。圖2：應(yīng)用細(xì)胞進(jìn)行不對(duì)稱還原。圖片來源：Nat. Chem.在確定了最優(yōu)反應(yīng)條件后，作者評(píng)估了該酶促還原反應(yīng)的底物使用范圍（表2）。結(jié)果表明，許多苯乙酮類底物都能被高效還原。除了簡(jiǎn)單的苯乙酮（7），對(duì)位含有不同取代基的苯乙酮也能以優(yōu)秀產(chǎn)率、幾乎完美的對(duì)應(yīng)選擇性被還原（8-12）。鄰位、間位的取代基對(duì)反應(yīng)也幾乎沒有影響（13-14，17）。但是當(dāng)鄰位取代基為-Cl時(shí)（15），反應(yīng)的對(duì)應(yīng)選擇性降為80%，對(duì)于底物16，對(duì)應(yīng)選擇性又重回95%。所以，該反應(yīng)的取代基及位阻效應(yīng)似乎并沒有一個(gè)統(tǒng)一的規(guī)律。對(duì)于非苯乙酮類底物，反應(yīng)也能成功進(jìn)行（18-22）。除了苯環(huán)及萘環(huán)外，其他雜環(huán)酮類底物，包含吡啶、噠嗪、呋喃及噻吩也能被兼容（23-28）。對(duì)于二羰基底物，反應(yīng)能高選擇性、高產(chǎn)率地還原具有較小位阻的羰基（29-30）。表2：適用于該反應(yīng)的底物范圍。圖片來源：Nat. Chem.從機(jī)理角度來講，路易斯酸和硅氫還原劑協(xié)同還原酮為醇可以經(jīng)過以下兩種反應(yīng)機(jī)理：第一種是鋅離子作為路易斯酸活化羰基，然后硅氫直接產(chǎn)生氫負(fù)離子進(jìn)攻活化的羰基最終生成醇；第二種是鋅與硅氫反應(yīng)生成Zn-H中間體，然后該金屬氫負(fù)中間體還原酮為醇。所以，在不加酮底物的時(shí)候，通過判斷是否能產(chǎn)生氫氣就能區(qū)分這兩種反應(yīng)機(jī)理，這是因?yàn)楣铓渑c水反應(yīng)不會(huì)產(chǎn)生氫氣但是金屬氫負(fù)中間體則能與水反應(yīng)生成氫氣。所以，作者就做了對(duì)照反應(yīng)（圖3a）：在無底物參與的條件下，在正常水作為溶劑時(shí)，反應(yīng)放出了H2；而在氘代水作為反應(yīng)溶劑時(shí)，反應(yīng)放出的則為HD。該實(shí)驗(yàn)有利證明了反應(yīng)經(jīng)歷了一個(gè)鋅與PhSiH3生成的Zn-H中間體。在排除了鋅離子作為路易斯酸活化底物羰基的反應(yīng)機(jī)理后，作者又提出了另外兩種可能的反應(yīng)機(jī)理（圖3b）：第一種是與鋅配位的氫氧根作為堿與硅氫配位后可以活化硅氫，活化的硅氫可以直接還原羰基；第二種則是通過一個(gè)Zn-H中間體還原羰基。如果反應(yīng)是經(jīng)過圖3b所示的第一種機(jī)理的話，那么具有不同產(chǎn)生氫負(fù)離子能力的硅氫就會(huì)具有不同的反應(yīng)效果；如果是第二種，則不會(huì)有明顯的差別。在此思路下，作者對(duì)比了不同硅氫的還原能力（圖3c）。PhSiH3和PhMeSiH2相比，PhMeSiH2具有更強(qiáng)的產(chǎn)生氫負(fù)的能力；但是對(duì)照反應(yīng)卻顯示在該反應(yīng)中，兩者的還原能力幾乎一樣。該實(shí)驗(yàn)就排除了圖3b中的第一種假設(shè)而間接證明了第二種機(jī)理。為了獲得更多的數(shù)據(jù)來支撐Zn-H中間體的生成，作者合成了三配位的Zn-O和Zn-F中間體，然后觀察其能否與硅氫反應(yīng)生成Zn-H結(jié)構(gòu)。結(jié)果證實(shí)，在模擬碳酸酐酶的三配位環(huán)境下，Zn-O和Zn-F中間體都能與硅氫反應(yīng)生成Zn-H結(jié)構(gòu)（圖3d）。
圖3：酶促還原反應(yīng)機(jī)理研究。圖片來源：Nat. Chem.為了進(jìn)一步研究該反應(yīng)的反應(yīng)機(jī)理，作者運(yùn)用了QM/MM方法對(duì)反應(yīng)機(jī)理做了計(jì)算。計(jì)算結(jié)果表明，PhSiH3、反應(yīng)底物都能合理地與酶促反應(yīng)位點(diǎn)結(jié)合；同時(shí)反應(yīng)位點(diǎn)附近的氨基酸也能通過氫鍵作用活化底物中的羰基（圖4a-d）。在綜合所有證據(jù)后，作者提出了如下的反應(yīng)機(jī)理：天然的碳酸酐酶中的Zn反應(yīng)位點(diǎn)可以與硅氫試劑進(jìn)行作用而生成Zn-H中間體，隨后被氫鍵活化的羰基底物可以被該氫負(fù)試劑還原，還原得到的烷氧中間體與水作用后生成目標(biāo)還原產(chǎn)物同時(shí)實(shí)現(xiàn)酶活性位點(diǎn)的循環(huán)（圖4e）。在作者進(jìn)行底物普適性探索時(shí)，作者發(fā)現(xiàn)，當(dāng)鄰溴苯乙酮為反應(yīng)底物時(shí)，反應(yīng)的非對(duì)映選擇性僅僅為10%（圖4f）。為了研究該底物為何如此特殊，作者特別運(yùn)用計(jì)算方法模擬了該底物與酶可能的結(jié)合方式。結(jié)果表明，除了氫鍵作用外，溴原子也可以通過鹵鍵作用與酶結(jié)合。兩種不同的作用使得Re、Si結(jié)合方式能量差別不大，進(jìn)而使得酶的手性環(huán)境并不能區(qū)分這兩種結(jié)合方式，最終造成還原該底物時(shí)的對(duì)映選擇性極低（圖4g，4h）。圖4：氫負(fù)離子產(chǎn)生及轉(zhuǎn)移過程的計(jì)算研究。圖片來源：Nat. Chem.總結(jié)：在這篇文章中，Hartwig課題組報(bào)道了一個(gè)利用碳酸酐酶作為催化劑、硅氫作為還原劑還原酮為二級(jí)醇的新方法。該方法能夠以高產(chǎn)率、高對(duì)映選擇性還原不同的酮，同時(shí)能夠兼容不同的官能團(tuán)及雜環(huán)，具有極強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值。更重要的是，該反應(yīng)巧妙結(jié)合了自然界中存在的天然酶與實(shí)驗(yàn)室中的非天然還原劑，成功實(shí)現(xiàn)了天然酶不能實(shí)現(xiàn)的新反應(yīng)，為發(fā)展其他酶促反應(yīng)提供了新思路。Ji, P., Park, J., Gu, Y. et al. Abiotic reduction of ketones with silanes catalysed by carbonic anhydrase through an enzymatic zinc hydride. Nat. Chem. (2021). https://doi.org/10.1038/s41557-020-00633-7
來源：高分子科學(xué)前沿
