有機磷農(nóng)藥(organophosphorus pesticides, OPs)由于具有成本低，合成簡便，對害蟲防治活性高等優(yōu)勢，已經(jīng)成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中使用最廣泛的殺蟲劑。因此，它的檢測是一個日益嚴重的公共衛(wèi)生問題。作為乙酰膽堿酯酶(AChE，一種關鍵的神經(jīng)系統(tǒng)酶)的底物類似物，OPs通過抑制AChE催化乙酰膽堿(ACh)水解發(fā)揮其毒性作用，導致ACh的過度積累從而引起膽堿毒性。 在過去的幾十年中，已經(jīng)建立了如液相色譜(LC)、氣相色譜(GC)和質(zhì)譜(MS)等方法檢測低濃度的OPs，但是這些方法的儀器昂貴，處理步驟繁瑣，分析速度慢，在現(xiàn)場檢測中受到限制。目前，一種簡單有效的檢測OPs的策略是使用基于酶的方法，該方法響應速度快，但由于酶易受環(huán)境影響，穩(wěn)定較差。隨著納米技術的進步，研究者嘗試將AChE固定在納米材料上以開發(fā)具有低檢測限，快速響應和穩(wěn)定性好的檢測OPs的生物傳感器。 石墨烯作為一種二維(2D)材料，具有較高的表面積、電子遷移率、導熱性和機械強度，最近報道的氧化石墨烯(graphene oxides, GO)還具有類過氧化物酶的活性，使其成為生物分析中天然酶的有效替代品。然而，很少有報道使用GO的內(nèi)在類過氧化物酶活性來靈敏地檢測OPs。 近日，吉林大學羅全教授與劉俊秋教授共同在《Nanoscale》發(fā)表了題為“Graphene oxide-based colorimetric detection of organophosphorus pesticides via a multi-enzyme cascade reaction”的研究論文。在該研究中，作者將合成的尺寸可調(diào)的氧化石墨烯(graphene oxides, GO)作為辣根過氧化物酶(HRP)模擬物，用于通過級聯(lián)反應比色檢測納摩爾濃度的有機磷農(nóng)藥(OPs)。這種基于GO比色法檢測OPs的方法具有高靈敏度和穩(wěn)定性，在公共衛(wèi)生應用領域具有巨大潛力。 示意圖為通過多酶級聯(lián)反應對OPs進行比色分析的原理圖。其中BA表示甜菜堿醛；oxTMB表示氧化的TMB。作者首先使用改進的Hummers方法制備尺寸可調(diào)的GO。該多酶級聯(lián)方法需要三種酶：AChE、膽堿氧化酶(choline oxidase，CHO)和GO依次起作用，其中AChE/CHO可以催化ACh和膽堿形成H2O2，從而激活GO將3,3,5,5-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)轉(zhuǎn)變成藍色產(chǎn)物。OPs對AChE的抑制作用導致H2O2產(chǎn)量急劇下降，導致視覺上顏色強度的變化，從而可以識別出各種低含量的OPs(例如樂果，甲基對氧磷和毒死蜱)。 圖一為通過改進的Hummers方法合成的GO-1和GO-2片層的AFM(a和b)和TEM(c和d)圖像。 AFM圖像表明，GO-1的平均直徑只有幾微米，厚度為1.4-2.1 nm (圖1a)，比單層石墨烯(0.7-1 nm)厚約2-3倍。相比之下，剝落的GO-2薄片比GO-1小得多。圖1b顯示的是高度為0.8-1.7 nm的納米片的形成，對應于1-2層的石墨烯結(jié)構。TEM圖像進一步表明，GO-1具有5-10 μm的細皺紋結(jié)構，而GO-2具有更不規(guī)則的形狀，尺寸分布為100-200 nm(圖1c-d)。這些結(jié)果與AFM數(shù)據(jù)一致，表明GO片層的尺寸可以通過合成條件輕松控制，利于后續(xù)基于酶方法的檢測。 圖二為GO-1(a和c)和GO-2(b和d)的全掃描X射線光電子能譜(XPS)和高分辨率C 1s能譜。由于先前有關碳納米材料催化機理的報道表明，GO的HRP活性高度依賴于其功能性氧基團(-C=O和O=C-O-基團)。因此，作者首先通過XPS分析來測量兩個GO片層的化學狀態(tài)。如圖2a和2b所示，在XPS光譜中觀察到了285和533 eV處的兩個強烈峰，這表明GO-1和GO-2具有相同的C和O主元素。XPS C 1s光譜可以進一步分解為三個不同的峰，其結(jié)合能分別為284.6 eV，286.6 eV和288.6 eV，分別對應于C=C/C-C，C-O和C=O鍵的峰。 圖三 (a)在不存在或存在GO納米片的情況下，TMB/H2O2反應溶液在652 nm處的時間依賴性吸收曲線；(b) GO-2在0至18 μg mL-1的濃度范圍內(nèi)具有劑量依賴活性；(c)和(d)分別為用于GO催化的最佳pH和溫度探索。由于GO具有類過氧化物酶活性，作者首先使用TMB-H2O2系統(tǒng)，通過652 nm處TMB的吸光度變化來評估GO-1和GO-2的活性。圖3a顯示了在含0.4 mM TMB和50 mM H2O2的pH 4.0 HAc-NaAc緩沖液中，有或沒有GO時溶液隨時間的吸光度變化。結(jié)果表明，單獨的H2O2幾乎不能氧化TMB引起顯著的顏色變化，而加入GO納米片后，該反應顯著加速，且相較于單獨的GO-1，GO-2具有更高的HRP活性。圖3b的結(jié)果表明，GO-2的反應速率隨其濃度的增加而增加，活性顯示出劑量依賴性。此外，作者還研究了pH，溫度和H2O2濃度對GO相對活性的影響。在pH 4.0時，GO擁有最大的相對活性(圖3c)，最佳溫度為35°C (圖3d)。 圖四 (a) GO-2/AChE/CHO介導的將TMB氧化為藍色oxTMB的反應；(b)用于基于GO比色分析AChE的劑量依賴性曲線；(c-e)為OP檢測的劑量反應曲線和半對數(shù)圖(插圖)，其中，圖c-e分別對應于檢測樂果、甲基對氧磷和毒死蜱。圖4a結(jié)果表示，在沒有OPs的情況下，GO-2/AChE/CHO/TMB系統(tǒng)顯示深藍色，而在其余兩種系統(tǒng)中均未觀察到明顯的顏色變化，表明AChE/CHO催化反應釋放H2O2導致GO-2催化TMB氧化。圖4b結(jié)果表示，反應溶液的顏色強度與AChE的濃度有關，表明該實驗可通過抑制AChE活性，基于比色法檢測殘留的OPs。對樂果、甲基對氧磷和毒死蜱的檢測限分別為2、1和2 ppb (ng mL-1)。 作者開發(fā)了一種基于GO的比色法用于OPs的靈敏檢測。結(jié)果表明，該方法檢測樂果、甲基對氧磷和毒死蜱的相應LOD低于2 ppb，均低于中國國家食品安全標準采用的最大殘留限量。此外，該檢測可以在40分鐘內(nèi)完成，對濃度在1–200 ng mL-1范圍內(nèi)的OP具有線性響應(R2值超過0.99)，顯示了其對農(nóng)藥殘留進行定量分析的巨大潛力。 羅全教授，2009年畢業(yè)于吉林大學理化所，獲理學博士學位。同年，加入超分子結(jié)構與材料國家重點實驗室任講師，2012年晉升為副教授，2018年晉升為教授。2015-2016年在美國明尼蘇達大學化學系做訪問研究。主要研究興趣包括計算生物與分子模擬，仿生催化與組裝，生物超分子功能材料等，相關成果在Chem. Rev.，Angew. Chem. Int. Ed.，ACS Catal.，ACS Appl. Mat. Inter.等國際SCI刊物上發(fā)表論文30余篇，累計他引674次。近年來，主持國家自然科學面上基金2項，青年基金1項，以及3項省科技廳重點研發(fā)項目/面上基金/青年基金，并獲吉林大學優(yōu)青培育計劃和優(yōu)秀青年教師培養(yǎng)計劃等項目支持。 研究興趣： 1.計算生物與分子模擬 2.仿生催化與組裝 3.生物超分子功能材料 劉俊秋教授，1987年畢業(yè)于吉林大學化學系，1999年在吉林大學化學系高分子專業(yè)分別獲理學碩士和博士學位。2002-2003年獲洪堡基金資助在德國從事博士后研究。2004年獲吉林省“首批拔尖創(chuàng)新人才”稱號，同年入選教育部“新世紀優(yōu)秀人才培養(yǎng)計劃”。2005入選吉林省創(chuàng)新人才工程。2010年獲得吉林省有突出貢獻的中青年專業(yè)技術人才稱號。2011年被評選為吉林省高級專家。主持或參加了多項國家863、973、自然基金重點研究項目等。近年來在Chem. Review, Chem. Soc. Review，Acc. Chem. Res.，J. Am. Chem. Soc.，Angew. Chem. Int. Ed等雜志已發(fā)表SCI研究論文150余篇，獲得吉林省科技進步一等獎1項(排名第一)。 研究興趣： 1.仿硒酶工程研究 2.超分子仿酶研究 3.蛋白質(zhì)組裝與功能化 原文鏈接：https://doi.org/10.1039/C9NR10862A DOI: 10.1039/c9nr10862a 編輯：周一黨 審核：CK 推送：小?
文獻分享| Nanoscale：基于氧化石墨烯的多酶級聯(lián)反應用于比色檢測有機磷農(nóng)藥
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