從貫葉連翹中分離得到兩個(gè)新的多環(huán)多戊烯基間苯三酚(PPAPs)，即Hyperfols A(1)和B(2)，以及兩個(gè)已知的生物合成相關(guān)前體化合物(3和4)?；衔?是罕見(jiàn)的具有5/5/9/5四環(huán)骨架的2，3-Seco-PPAP，化合物2具有30-norPPAP。通過(guò)光譜分析、計(jì)算機(jī)輔助結(jié)構(gòu)解析軟件和電子圓二色譜計(jì)算確定了它們的結(jié)構(gòu)。此外，化合物1和4通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡對(duì)人紅白血病細(xì)胞具有顯著的細(xì)胞毒作用。
//研究背景
多環(huán)多戊烯基間苯三酚(PPAPs)是一類(lèi)結(jié)構(gòu)有趣的代謝物，其特點(diǎn)是高氧?；g苯三酚密集地被戊烯基或香葉基側(cè)鏈取代。PPAP是由單環(huán)多戊烯基間苯三酚(MPAPs)生物合成而來(lái)，然后進(jìn)一步環(huán)化形成不同類(lèi)型的PPAP，如金剛烷、螺環(huán)、橋環(huán)和其他一些復(fù)雜的骨架。到目前為止，大約有700種天然的多酚結(jié)合蛋白是從藤黃屬中分離出來(lái)的，它們表現(xiàn)出非常廣泛的生物活性，包括細(xì)胞毒性、抗菌、抗氧化和抗抑郁活性。因此，PPAPs的研究正成為有機(jī)合成和藥理學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。
正在進(jìn)行的金絲桃屬植物中結(jié)構(gòu)獨(dú)特的PPAP進(jìn)行研究的，有兩個(gè)新的PPAP，hyperfols A(1)和B(2)(圖1)，從貫葉連翹地上部分分離得到兩個(gè)已知生物合成相關(guān)的前體化合物：Hyhenrone A(3)和Hyperurone E(4)?；衔?具有不尋常的5/5/9/5稠合四環(huán)體系，具有稀有的九元氧環(huán)和兩個(gè)γ-內(nèi)酯環(huán)。化合物2是C30或非雙環(huán)多戊烯基?；g苯三酚(BPAP)類(lèi)似物的第一個(gè)例子。在這里，描述了這些化合物的結(jié)構(gòu)解釋?zhuān)此坪侠淼纳锖铣赏緩剑约凹?xì)胞毒性評(píng)價(jià)。
圖1.化合物1和2的結(jié)構(gòu)
//結(jié)構(gòu)解析
Hyperfols A(1)，根據(jù)13C NMR和高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析其分子式C35H50O6。1HNMR譜顯示3個(gè)烯烴質(zhì)子[δH4.82(1H，t，J=7.2 Hz)，4.96(1H，t，J=7.2 Hz)和5.2 0(1H，t，J=7.2 Hz)]和11個(gè)單線(xiàn)甲基。1的13C和極化轉(zhuǎn)移(DEPT)無(wú)畸變?cè)鰪?qiáng)NMR數(shù)據(jù)顯示35個(gè)碳，包括3個(gè)戊烯基。此外，剩余的20個(gè)碳信號(hào)被歸屬于5個(gè)甲基、3個(gè)亞甲基、2個(gè)亞胺和10個(gè)季碳，其中觀察到1個(gè)酮、2個(gè)酯羰基和4個(gè)雙鍵。上述官能團(tuán)占7個(gè)不飽和度，其余4個(gè)不飽和度暗示存在四環(huán)系統(tǒng)。
通過(guò)分析其2D NMR數(shù)據(jù)，進(jìn)一步確定1的平面結(jié)構(gòu)(圖2A)。1H?1H COSY相關(guān)性顯示存在四個(gè)結(jié)構(gòu)片段a?d，如圖2中粗鍵所示。通過(guò)異核多鍵相關(guān)譜(δC81.4)，從Me-35到C-1，C-8和C-29，從H-31到C-1和C-8，從Me-33和Me-34到C-31和C-32(C81.4)很容易地構(gòu)建了一個(gè)帶有異丙氧基的環(huán)(環(huán)A)。根據(jù)H-31與C-2(δC 173.8)和C-10(δC137.9)以及Me-12和Me-13與C-11和C-10的HMBc關(guān)聯(lián)，異丁烯基和酯羰基(C-2)通過(guò)C-1連接到A環(huán)。片段a和b可以很容易地通過(guò)Me-35與C-7和C-8的關(guān)鍵HMBC關(guān)聯(lián)起來(lái)。此外，通過(guò)H2-6和H2-19與C-4、C-5和C-9的HMBC關(guān)聯(lián)，片段b和c、羰基(C-4)和酯羰基(C9)通過(guò)C-5相互連接。同樣，通過(guò)H2-14與C-3和C-4的HMBC關(guān)聯(lián)驗(yàn)證了d單元和C-4通過(guò)四元C-3的連接。因此，具有六個(gè)“松散末端”的結(jié)構(gòu)可以如圖2A所示。然而，由于與這些基團(tuán)相關(guān)的季碳化合物的存在以及缺乏關(guān)鍵的HMBC相關(guān)性，這六個(gè)“松散末端”之間的聯(lián)系極具挑戰(zhàn)性。計(jì)算機(jī)輔助結(jié)構(gòu)解釋(CASE)是近幾年發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)通過(guò)數(shù)據(jù)解釋來(lái)組裝復(fù)雜結(jié)構(gòu)的技術(shù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)包括分子式和1的1D和2DNMR數(shù)據(jù)輸入到ACD/結(jié)構(gòu)解析器中，可以產(chǎn)生209個(gè)分子并進(jìn)行篩選。通過(guò)軟管(dA)和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(dN)方法顯示了最高的R2值和最低的標(biāo)準(zhǔn)差值(圖3)，因此，確定了1的平面結(jié)構(gòu)，如圖3所示。
圖2.化合物1關(guān)鍵的HMBC、1H?1H和ROESY相關(guān)
圖3.采用Struc Eluc軟件，預(yù)測(cè)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法進(jìn)行線(xiàn)性回歸圖
ROESY光譜來(lái)確定化合物1的相對(duì)構(gòu)型(圖2B)，其中H-31/Me-35/H-24a和Me-12/Me-35/H-6β的相關(guān)性表明，這些基團(tuán)位于分子的同一側(cè)，并隨機(jī)指定為β定向的。此外，H-19/H-6、α/H-7和H-14/H-20的ROESY相關(guān)性表明這些群體是以α為導(dǎo)向的。因此，1的相對(duì)結(jié)構(gòu)被闡明，如圖2所示。
根據(jù)其HR-ESI-MS數(shù)據(jù)確定hyperfols B(2)的分子式為C29H40O5。對(duì)其1D和2DNMR數(shù)據(jù)的分析表明，2與hyphenrone A(3)相似。不同之處在于2中存在α，β不飽和酮單元(δC201.6、139.1和150.6)，而不是3中存在的戊烯基。此外，在HMBC譜(圖4)中，H-24到C-8，H-7和Me-29與C-8，C-1和C-2的相關(guān)關(guān)系進(jìn)一步構(gòu)成了2的平面結(jié)構(gòu)。根據(jù)ROESY譜確定了它的相對(duì)構(gòu)型，其中H-19b/H6α/H-7和H-14a/H-20的關(guān)聯(lián)表明這些質(zhì)子是α取向的，而H-6β/H-24a的相關(guān)性表明它們是β取向的(圖4)。據(jù)我們所知，所有來(lái)自單環(huán)多戊烯基?；g苯三酚(MPAP)前體的PPAP都顯示在C-8上存在二甲基，2丟失30-甲基是一種新的PPAP。
圖4.化合物2的關(guān)鍵HMBC、1H?1H COSY和ROESY的相關(guān)性.
用含時(shí)密度泛函理論(TDDFT)方法在B3LYP/6-311+g(d，p)或CAM-B3LYP/TZVP水平上計(jì)算了1和2的絕對(duì)構(gòu)型。將理論計(jì)算數(shù)據(jù)與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較(圖5)，可以將1和2的絕對(duì)構(gòu)型分別指定為1R、3R、5R、7S、8R、31R和3S、5R、7S。
圖5. 化合物1和2的實(shí)驗(yàn)和計(jì)算的ECD譜
假設(shè)的生物發(fā)生途徑為1?4，如路徑1所示。中間體(3)可由MPAP經(jīng)烷基化、環(huán)化、氧化、還原-羥醛縮合等一系列反應(yīng)得到，2進(jìn)一步氧化得到4。重要的中間體I是通過(guò)拜爾?維利格氧化形成的。酯環(huán)被打開(kāi)，雙鍵被氧化得到關(guān)鍵中間體II。最后，以II為原料，通過(guò)醚化和酯化反應(yīng)合成了一個(gè)特殊的5/5/9/5四環(huán)骨架(1)。相反，中間體III是通過(guò)MPAP在C-8的氧化而損失一個(gè)30-甲基得到的。
路徑1.化合物1-4的生物合成途徑
中間體IV由III經(jīng)Aldol縮合而得，再經(jīng)逆轉(zhuǎn)Aldol反應(yīng)和OH-8脫水得到化合物2。多環(huán)多戊烯基衍生物已被報(bào)道對(duì)白血病有抑制作用。因此，我們測(cè)定了所有分離株對(duì)白血病細(xì)胞系HEL和K562的細(xì)胞毒活性?；衔?和4對(duì)HEL細(xì)胞有明顯的細(xì)胞毒作用，IC50值分別為5.01和7.38μM。此外，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明，化合物1和4均能誘導(dǎo)HEL細(xì)胞凋亡，并呈劑量依賴(lài)關(guān)系(圖6A，B)。但是，由于化合物1的量較少，所以使用了化合物4進(jìn)行進(jìn)一步的研究。觀察化合物4對(duì)細(xì)胞凋亡標(biāo)志蛋白caspase-3和PARP表達(dá)的影響。結(jié)果表明，4可促進(jìn)caspase-3和PARP1的裂解水平表達(dá)(圖6C)?？傮w而言，化合物1和4通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡對(duì)HEL細(xì)胞具有細(xì)胞毒作用。
圖6.
(A,B)化合物1和4誘導(dǎo)HEL細(xì)胞凋亡24小時(shí)
(C) Western blot顯示，化合物4不同濃度處理HEL細(xì)胞24小時(shí)后，所示抗體表達(dá)活化的caspase-3和PARP。
綜上所述，從貫葉連翹地上部分分離到兩個(gè)前所未有的PPAP，分別為hyperfol A(1)和hyperfol B(2)。Hyperfols A(1)具有罕見(jiàn)的5/5/9/5四環(huán)系統(tǒng)的骨架和2有新穎的30-norPPAP。化合物1和2的新穎結(jié)構(gòu)吸引了合成化學(xué)家的興趣。此外，化合物1和4通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡對(duì)HEL細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞毒作用。
//原文信息
本文于2020年8月21日在線(xiàn)發(fā)表于ACS旗下期刊Organic Letters上。第一作者為Hua-Yong Lou和Ya-Nan Li，通訊作者為Chun-Mao Yuan和Xiao-Jiang Hao。通訊單位為貴州醫(yī)科大學(xué)藥用植物功效與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。
原文地址：
https://dx.doi.org/10.1021/acs.orglett.0c02434
